耻垢分枝杆菌对于抗菌肽COG1410的耐药机制研究

作     者：王纯 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡春梅

授予年度：2024年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：抗菌肽 COG1410 耐药机制 ClpC Clp蛋白酶 耻垢分枝杆菌 

摘      要：研究背景与目的 非结核分枝杆菌(Non-tuberculous Mycobacteria,简称NTM)是一类与结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)相似但不引起结核病的分枝杆菌。NTM由于其与结核分枝杆菌的相似性,通常会在临床上引起类似结核病的感染症状,包括呼吸道感染、皮肤感染、淋巴结感染等。NTM是一类异质性很高的菌群,包括数百种菌株,其中有些菌株对抗生素的敏感性和耐药性不同。当前可用于治疗NTM的有效药物有限,而且随着抗生素的过度使用,NTM对药物的耐药性也在逐渐加剧。因此,迫切需要研究开发新型针对非结核分枝杆菌的药物,以提高对耐药性NTM的治疗效果和生物利用度。最近,抗菌肽(AMP)有望成为应对细菌感染的替代品,以解决全球抗生素耐药性的紧迫威胁,因为抗菌肽具有独特的杀菌机制,并且不易导致细菌产生耐药性。在之前的研究中发现抗菌肽COG1410对于临床上多种耐药细菌以及全耐药细菌都表现出很好的杀菌活性。COG1410是一种源自载脂蛋白E的合成肽,对多种细菌菌株(包括耻垢分枝杆菌)表现出有效的抗菌特性。因此,我们选择了该抗菌肽及其改良肽作为研究对象,针对快速生长型非结核分枝杆菌中的耻垢分枝杆菌深入研究其耐药机制。 研究方法 (1)首先利用连续传代,诱导耻垢分枝杆菌对抗菌肽COG1410产生耐药,并通过全基因组测序比较分析野生型菌株与耐药菌株有无突变位点; (2)经过进一步分析确定单个突变位点为研究对象,通过对突变基因过表达和敲低来观察表型是否受影响; (3)然后经查阅文献确定突变位点所在蛋白的功能,通过分别研究目的蛋白和突变后的蛋白功能进一步探索抗菌肽蛋白功能的影响; (4)最后通过荧光共聚焦显微镜直接观察抗菌肽COG1410与目的蛋白的相互作用情况,并通过SPR分析抗菌肽分别与目的蛋白和基因突变后蛋白的亲和力。 研究结果 (1)COG1410可增强ClpC的ATPase活性,也可增强Clp蛋白的蛋白水解活性;S437P点突变可与其产生协同效应。 (2)COG1410能够直接进入耻垢分枝杆菌的细胞质与ClpC相互作用;COG1410与ClpC的N-域结合,与ClpC有很强的亲和力,且S437P突变不会影响其结合力。 (3)耻垢分枝杆菌对COG1410产生耐药性与ClpC的点突变紧密相关,是抗菌肽耐药的一个靶点,其他抗菌肽也有同样的表型,而抗生素不同。对于细菌本身来说,当抗菌肽浓度升高时,细菌会刺激自身ClpC表达量来抵抗抗菌肽的侵入。 (4)COG1410会扰乱耻垢分枝杆菌的正常代谢过程。 研究结论 在细菌世界中,抗菌肽(AMPs)是一类天然存在的小分子抗菌剂,具有多样的结构和杀菌机制。然而,细菌往往通过各种耐药机制来对抗这些抗菌肽的杀菌作用。在本研究中,我们发现了分枝杆菌中针对AMPs的一种独特的耐药机制,这为我们理解细菌如何对抗AMPs提供了新的视角。特别值得注意的是,我们的研究突出了 ClpC在分枝杆菌中对抗AMPs耐药机制中的关键作用。ClpC作为一种蛋白质分解机制中的分子伴侣,参与了细菌对抗菌肽的耐药性调控过程。通过与COG1410抗菌肽的相互作用,ClpC发挥着调节AMPs耐药性的重要作用,这为我们深入了解分枝杆菌对抗菌肽的耐药机制提供了重要线索。总的来说,本研究不仅揭示了分枝杆菌中对抗菌肽的独特耐药机制,还突出了 ClpC在其中的关键作用。这些发现为我们更好地理解细菌-抗菌肽相互作用提供了重要启示,并为未来开发新型抗菌药物以应对抗生素耐药性提供了有益的思路。