藜麦甜菜素合成基因CYP76AD、DODA的鉴定及功能研究

作     者：李莉 

作者单位：成都大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴琪

授予年度：2024年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：CqCYP76AD CqDODA 基因调控 甜菜素合成 藜麦 

摘      要：藜麦(Chenopodium quinoa Willd,2n=4x=36)是一年生双子叶草本植物,含丰富蛋白质、膳食纤维、人体必需氨基酸,具有低热量、低脂肪等特性;一种单一作物即能满足人体基本需要的粮食作物。自2017年参考基因组公布以来,不同功能的基因相继被挖掘和克隆,推动着藜麦遗传育种研究。藜麦因其植株和种子色彩丰富而被受关注,其较高的生存适应性主要得益于其富含大量甜菜素。甜菜素作为一种由酪氨酸衍生而来,在细胞质中合成并存在于液泡中的水溶性天然色素,对植物的色彩、生长发育及抵抗各种胁迫起着重要作用,已被广泛应用于食品生产、医药、化妆品等各大领域。因此,通过对藜麦甜菜素生物合成的研究,对于藜麦分子育种研究和品质提升具有重大意义。 目前为止,针对藜麦甜菜素的研究还相对较少,用于富甜菜素生物育种的基因资源有待开发。为此,本研究首先利用生物信息学对藜麦全基因组进行鉴定,分析了藜麦甜菜素合成相关基因CqCYP76AD、CqDODA的系统进化、基因结构及基序分布、染色体定位、基因复制及进化关系;然后,利用光周期甜菜素积累和基因表达模式进行WGCNA分析,从中筛选出可能参与甜菜素生物合成的候选基因;之后利用RT-q PCR对不同色彩的藜麦植株中候选CqCYP76AD、CqDODA基因进行表达模式分析;最后,利用毛状根转化、烟草瞬时表达体系和亚细胞定位对候选基因CqCYP76AD、CqDODA进行功能研究。主要研究结果如下: (1)藜麦全基因组中鉴定得到44个CqCYP76AD基因和18个CqDODA基因。根据系统发育树将44个藜麦CYP76AD基因命名为CqCYP76AD-α1-CqCYP76AD-γ33,18个DODA基因被命名为CqDODA-α1-CqDODA-γ6;CqCYP76AD基因被分为α(5个成员)、β(6个成员)、γ(33个成员)三个分支;18个CqDODA基因同样被分为α(10个成员)、β(2个成员)、γ(6个成员)三个分支。进化分析显示CqCYP76AD和CqDODA家族主要通过串联复制和片段复制进行基因家族的扩张。 (2)WGCNA分析筛选得到可能参与藜麦甜菜素生物合成的5个CqCYP76AD和2个CqDODA基因。光周期结果显示藜麦甜菜素在长日照条件下高表达,利用光周期甜菜素含量与基因表达模式进行的WGCNA分析在正调控的模块中筛选到(CqCYP76AD-α1)AUR62012346、(CqCYP76AD-α4)AUR62012350、(CqCYP76AD-β2)AUR62030889、(CqCYP76AD-γ2)AUR62022710、(CqCYP76AD-γ15)AUR62016945、(CqDODA-α5)AUR62012345、(CqDODA-β2)AUR62006953基因可能参与甜菜素生物合成。 (3)对5种不同颜色藜麦材料的三个生育阶段的叶、茎、穗中的甜菜素含量和基因表达量进行分析。发现CqCYP76AD-α1、CqCYP76AD-γ2、CqDODA-α1、CqDODA-α3、CqDODA-α5在甜菜素含量较高的藜麦组织中高表达,表明CqCYP76AD-α1、CqCYP76AD-γ2、CqDODA-α1、CqDODA-α3、CqDODA-α5可能是参与藜麦甜菜素生物合成的关键基因。 (4)构建甜菜素候选基因-GFP载体,注射含载体农杆菌至普通烟草叶片,利用激光共聚焦荧光显微镜观察表皮细胞,发现CqCYP76AD-α1、CqCYP76AD-β3、CqCYP76AD-γ2蛋白主要定位在细胞质中,CqDODA-α1、CqDODA-α3、CqDODA-α5、CqDODA-β2、CqDODA-α6蛋白主要定位在细胞质、细胞核中。 (5)CYP76AD家族中仅有α和β分支的基因参与甜菜素的合成,而γ分支的基因则不参与甜菜素生物合成;DODA家族中仅有α分支的基因参与藜麦甜菜素的合成,β和γ分支的基因均不参与藜麦甜菜素合成。8个候选基因分别通过Ar.A4发根农杆菌转化体系获得转基因毛状根。RT-q PCR分析表明阳性毛状根中CqCYP76AD和CqDODA基因表达提高至少3倍,最高可达800倍;甜菜素含量测定结果显示基因表达量与甜菜素含量呈正调控关系。CqCYP76AD-α1是藜麦甜菜素生物合成的关键基因,同时具有酪氨酸羟化酶和氧化酶活性;烟草中瞬时表达结果表明,CqCYP76AD-β3在藜麦甜菜素合成中仅编码酪氨酸羟化酶、CqDODA-α1、CqDODA-α3、CqDODA-α5在甜菜素合成中编码4,5-多巴外二醇双加氧酶,而CqCYP76AD-γ2、CqDODA-β2、CqDODA-γ6可能不参与甜菜素的生物合成。