阿巴西普预防急性移植物抗宿主病的基础及临床研究

作     者：朱锦锦 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈佳

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 100215[医学-康复医学与理疗学] 10[医学] 

主      题：阿巴西普 单倍体造血干细胞移植 急性移植物抗宿主病 免疫重建 免疫卡控点分子 

摘      要：[背景]异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是多数恶性血液系统疾病唯一具有治愈效果的治疗方式。急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)是 allo-HSCT 后的主要并发症,尤其是在单倍体造血干细胞移植(haploidentical hematopoietic stem cell transplantation,haplo-HSCT)中,其发生率可高达50%。尽管随着临床实践经验累积,aGVHD防治手段已经从经典的药物预防手段转变到包括基因和细胞疗法在内的创新防治方法,但aGVHD仍然是allo-HSCT后患者死亡的重要原因。aGVHD发生机制是供体来源的T细胞在发挥抗白血病/肿瘤(graft versus leukemia/tumor,GVL/GVT)作用的同时攻击了受体靶组织,其防治的目标是减轻供体T细胞的有害损伤,同时保留和增强GVL/GVT效应。阿巴西普(Abatacept)是一种可溶性的CTLA-4融合蛋白,由CTLA-4的胞外结构域与人免疫球蛋白G1的Fc结构域的一个片段(铰链-CH2-CH3结构域)组成。阿巴西普可以与CD28竞争性结合抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APCs)表面的CD80/CD86,从而起到抑制T细胞增殖活化、诱导移植免疫耐受的作用。2020年皮下剂型阿巴西普进入了中国市场,我们开展了皮下剂型阿巴西普预防aGVHD的有效性和安全性的基础及临床研究,旨在明确阿巴西普控制haplo-HSCT后aGVHD的疗效及安全性,探索其免疫机制,为中国人群haplo-HSCT后预防aGVHD探索新的治疗策略。[方法]在第一部分中,使用野生型C57BL/6(SPF级,H-2b,雌性)小鼠作为供体鼠,BALB/c(SPF级,H-2d,雌性)小鼠作为受体鼠,构建小鼠aGVHD模型,采用不同浓度的阿巴西普皮下注射,记录受体小鼠生存和aGVHD组织病理评分,以初步判断阿巴西普是否能改善小鼠aGVHD,并评估用于改善小鼠aGVHD的皮下剂型阿巴西普最适宜用量。后续采用最适宜剂量的阿巴西普进行小鼠aGVHD预防,记录受体小鼠生存、体重和aGVHD临床评分,使用流式细胞仪检测移植后小鼠的免疫细胞亚群数量及比例恢复情况、胞内细胞因子和细胞表面免疫卡控点分子的表达情况。选取HLA-A2(02:01)阴性的健康人类外周血单个核细胞为供体干细胞,选取SPF级B-NDG HLA-A2.1小鼠作为受体鼠,构建人源化aGVHD小鼠模型,探索阿巴西普对人源化小鼠生存率的影响。在第二部分中,我们进行了一项前瞻性临床试验(注册号NCT04686929),评估阿巴西普在haplo-HSCT期间预防aGVHD的安全性、有效性和免疫学效应。阿巴西普组患者在HSCT期间接受皮下注射阿巴西普250mg(d-1),125mg(d+5,d+14,d+21,d+28,d+35,d+42,d+49,d+56),同时联合环孢素、甲氨蝶呤及霉酚酸酯预防aGVHD。主要研究终点是移植后100天内的Ⅱ-Ⅳ度aGVHD,次要研究终点是治疗相关死亡率和复发率。为了探索阿巴西普的免疫学效应,我们筛选了同时期进行haplo-HSCT且不采用阿巴西普预防aGVHD的患者作为对照组。收集两组患者移植后新鲜外周血标本,通过流式细胞术检测两组患者免疫细胞亚群、胞内细胞因子及细胞表面分子数量和比例,通过外周血CD3+T淋巴细胞转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)探究阿巴西普调控aGVHD的分子机制。[结果]1.在第一部分,我们通过构建小鼠异基因移植aGVHD模型,探索使用阿巴西普对受体小鼠aGVHD的调节作用及机制。(1)通过剂量探索试验发现,与生理盐水皮下注射的对照组相比,不同剂量的阿巴西普(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg)均可改善异基因移植受体小鼠的生存。病理学检查提示5mg/kg的阿巴西普对aGVHD组织病理损伤的保护作用最为显著。但由于5mg/kg和10mg/kg这两组较小的药物用量均可显著改善异基因移植小鼠生存,因此我们进一步将这两个阿巴西普治疗组的异基因移植受体小鼠与对照组小鼠对比,结果发现5mg/kg的阿巴西普治疗剂量可以更有效地保护小鼠体重,减轻aGVHD表现。因此,后续的小鼠实验均采用阿巴西普5mg/kg皮下注射。(2)与对照组小鼠相比,接受阿巴西普5mg/kg皮下注射治疗的异基因移植小鼠外周血、肺和肝脏中CD4+T细胞的比例下降,CD8+T细胞的比例升高。此外,阿巴西普抑制了受体小鼠脾脏CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化以