红色诺卡氏菌次级代谢产物的分离纯化及活性评价

作     者：安芳芳 

作者单位：福建师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑永标

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：红色诺卡氏菌 化学成分 结构解析 活性评价 

摘      要：红色诺卡氏菌是从土壤中分离得到的一种诺卡氏菌。诺卡氏菌属与红球菌属、分枝杆菌属、以及棒状杆菌属等共同组成了一种CMNR放线菌群体,有独特的细胞壁成分及结构,其细胞壁是由分枝菌酸、阿拉伯半乳糖、肽聚糖共价结合而成。目前,红色诺卡氏菌的细胞壁骨架（Nr-CWS）已作为药物应用,Nr-CWS是红色诺卡氏菌经发酵培养、细胞破碎、酶处理、有机溶剂提取后,通过研磨、乳化、冷冻干燥制成一种白色粉末,是一种免疫增强剂,具有刺激先天免疫活性和抗肿瘤活性。本文采用有机溶剂和化学试剂相结合,综合应用凝胶LH-20、正相硅胶和反相硅胶RP-C18柱层析及薄层层析技术对红色诺卡氏菌菌丝体、发酵液及细胞壁骨架的化学成分进行较系统分离纯化,并根据核磁共振波谱数据进行结构解析,并初步评价了相关活性,以期为红色诺卡氏菌代谢产物的进一步开发利用提供依据。红色诺卡氏菌菌丝体化学成分的分离纯化采用3种方式:（1）采用甲醇和氯仿浸提湿菌丝体,从12.6 g菌体获得粗提物E（0.944 g）,分离到化合物FF03和FF05;（2）采用10%四丁基氢氧化铵100℃水浴8 h,二氯甲烷萃取,从13.4 g菌体获得粗提物G（2.130 g）,分离到化合物FF06、FF07、FF09及FF23;（3）10%氢氧化钾80℃水浴1 h,二氯甲烷萃取,从13.3 g菌体获得粗提物H（1.003 g）,分离到化合物FF13、FF14、FF15、FF17。根据核磁共振波谱数据,化合物FF07、FF17、FF23分别解析为heptadecan-8-ol、n-octacos-9-enyl propionate、（E）-dodec-5-enoic acid;FF03、FF06及FF14解析为3-hydroxy-2-（tetradecanoyloxy）propyl（E）-tricos-9-enoate;FF05及FF13解析为methyl（E）-octacos-14-enoate;FF09及FF15解析为分枝菌酸methyl（E）-3-hydroxy-2-octadecylhexacos-12-enoate。分枝菌酸是有抗肿瘤作用的长链脂肪酸,粗提物G中分枝菌酸的得率为12.6%,粗提物H中分枝菌酸的得率为8.7%。除分枝菌酸外,其余化合物为首次从红色诺卡氏菌中分离得到。将18 L红色诺卡氏菌发酵液进行反相硅胶柱吸附,接着以不同浓度甲醇水洗脱（纯水、15%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）,分别浓缩后得到浸膏9.35 g、1.37 g、14.87 g、3.15 g、0.29 g、0.09 g。用乙酸乙酯:水=1:1分别萃取得到粗提物F1（25.8 mg）、F2（8.7 mg）、F3（103.4 mg）、F4（49.6 mg）、F5（25.3mg）、F6（80.4 mg）,接着用正丁醇:水=1:1分别萃取得到粗提物F7（990.9 mg）、F8（185.4 mg）、F9（2810.1 mg）、F10（320.3 mg）、F11（54.7 mg）、F12（5.2 mg）。对粗提物进行分离,从F3中分离到化合物FF10,F4中分离到化合物FF19,F8中分离到化合物FF25及FF26。根据核磁共振波谱数据,化合物FF10、FF19、FF25及FF26分别解析为Cyclo（L-leucyl-L-prolyl-L-leucyl-L-prolyl）、brevianamide F、butylβ-D-glucopyranoside、L-tryptophan,是首次从红色诺卡氏菌中分离得到。将红色诺卡氏菌菌丝体及发酵液中分离到的化合物（FF03、FF07、FF10、FF13、FF17、FF19、FF23、FF25）进行抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制、乙酰胆碱酯酶抑制、酪氨酸酶抑制活性检测。结果表明,化合物FF19、FF23、FF25有明显的抗氧化活性。化合物FF03、FF13、FF15、FF23浓度为71.41μg/m L时,对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为16.87%、96.14%、42.31%、95.62%,其中化合物FF13的IC为20.56μg/m L。化合物FF03、FF25在浓度为100μg/m L时,对乙酰胆碱酯酶的抑制率分别为68.37%、70.40%,其中化合物FF25的IC为74.76μg/m L。化合物FF10、FF25在浓度为500μg/m L时,对酪氨酸酶的抑制率分别为27.95%、11.10%。采用不同化学试剂对红色诺卡氏菌细胞壁骨架进行降解,离心后,将上清液浓缩,获得总降解产物,并利用TLC初步分析了降解产物。取细胞壁骨架20 mg,用10 m L 20%氨水溶液,37℃140 r/min恒温振荡6 d,处理后得到产物6.1 mg,得率30.5%;取细胞壁骨架28.9 mg,