日本鳗鲡FADD基因的克隆及其免疫与细胞凋亡功能分析

作     者：王添禹 

作者单位：集美大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯建军

授予年度：2024年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：日本鳗鲡 FADD 细胞凋亡 免疫应答 信号通路 

摘      要：FADD(Fas相关死亡域蛋白)是细胞凋亡过程中的一个重要信号分子,在死亡受体介导的细胞凋亡中发挥关键作用。然而,目前有关硬骨鱼FADD免疫功能的研究还十分薄弱。本研究首次克隆了日本鳗鲡(Anguilla japonica)FADD基因的c DNA全长序列,命名为Aj FADD。氨基酸序列分析以及同源比对分析表明:Aj FADD含有一个DED结构域和一个DEATH结构域,其蛋白质空间三维结构与人类、斑马鱼以及亚洲龙鱼相似。系统发育树显示Aj FADD与其他硬骨鱼类的FADD聚为一支,哺乳类、鸟类、两栖类分别聚为一支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测分析了Aj FADD基因在体和离体细胞表达水平变化。天然状态下,Aj FADD基因在日本鳗鲡各组织中均有表达,其中肝脏表达量最高,心脏和肌肉中的基因表达水平相对较低。LPS、poly I:C以及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)免疫刺激后能够引起日本鳗鲡肾脏、脾脏和肝脏的Aj FADD基因表达水平显著升高。离体实验结果显示poly I:C、LPS、Cp G以及不同浓度嗜水气单胞菌均显著诱导Aj FADD表达水平升高。构建日本鳗鲡pc DNA3.1-FADD、pc DNA3.1-Caspase-8真核表达载体,进而与IFN3、NF-κB、Cathelicidin1以及TNF-α启动子报告基因共转染至HEK-293T细胞中,检测发现IFN3、NF-κB、Cathelicidin1以及TNF-α启动子报告基因双荧光素酶活性显著提高,且FADD与Caspase-8表现出协同作用。日本鳗鲡p EGFP-Aj FADD绿色荧光重组蛋白的亚细胞定位显示,Aj FADD在细胞质中呈聚集状分布,推测该蛋白主要在细胞质中发挥其免疫调节作用。日本鳗鲡pc DNA3.1-FADD在日本鳗鲡肝脏细胞过表达后,发现Aj FADD显著上调肝脏细胞免疫相关基因的表达,包括Ⅰ型IFN通路的IFN1、IFN3、IFN4、IRF3、IRF5和IRF7,NF-κB信号通路的c-Rel和p65,MAPK信号通路的c-Fos和c-Jun,下游重要的炎症细胞因子IL1、IL6和TNF-α,以及重要的抗菌肽分子LEAP-2。此外,Aj FADD基因通过在体和离体RNA干扰(RNAi)后,上述基因的表达水平在日本鳗鲡肝脏、脾脏、肾脏以及日本鳗鲡肝脏细胞中均有显著降低。流式细胞和伤口愈合试验检测结果显示Aj FADD、Aj FADD/Caspase-8抑制了细胞的活性与迁移效率,促进了细胞凋亡进程。免疫共沉淀(CoIP)显示Aj FADD与Aj Caspase-8存在蛋白-蛋白相互作用。以上结果表明,一方面,Aj FADD通过激活IRF3和IRF7介导的I型IFN信号通路参与了机体的抗病毒免疫应答反应,并通过激活NF-κB或MAPK信号通路诱导炎性细胞因子以及抗菌肽的表达,从而参与机体对细菌感染的免疫应答反应。另一方面Aj FADD与Aj Caspase-8可通过蛋白与蛋白之间的相互作用,协同促进细胞的凋亡过程。