表面增强拉曼散射生物传感器结合核酸信号放大策略在口腔癌早期诊断中的应用

作     者：张雅彤 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄锦华

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：口腔鳞状细胞癌 miRNAs 表面增强拉曼散射技术 杂交链式反应 金纳米片 

摘      要：一、背景与目的口腔癌作为人类最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的生命,早期筛查和诊断能够有效降低死亡率,是影响口腔癌预后的因素。目前切取组织活检仍旧是早期口腔癌诊断的主要手段,但其具有一定的创伤性和潜在并发症,对具有可疑病变的患者实施大规模的筛查是不现实的。传统的检测方法大多都依靠医师的经验、知识和其他因素,这导致早期肿瘤的识别十分困难。微小RNAs(MicroRNAs)可以稳定存在于人血清、尿液、唾液等体液中,其表达水平与癌症的发生发展密切相关,被认为是肿瘤生物标志物,是目前的研究热点。然而由于miRNAs在疾病早期的含量较低,诊断口腔癌的灵敏度较差。因此,开发一种更加灵敏、特异、高效的新技术用于口腔癌诊断迫在眉睫。表面增强拉曼散射技术(surface enhanced Raman scattering,SERS)因具有高特异性、高灵敏度及无损检测的特点从而广泛应用于疾病诊断、生物医学领域。杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)是一种可在常温下进行,不需要酶反应,且操作简单有效的信号放大技术。此外,HCR与其他检测技术有着良好的兼容性可以有效提高核酸、蛋白质等生物分子检测的灵敏度,且因没有酶的参与,还可以提高检测的准确性。本研究旨在以口腔鳞状细胞癌中miR-31和miR-21为检测物,研究并提出表面拉曼散射技术结合HCR核酸信号放大策略,用于开发一种高灵敏度、高特异性的新型生物传感器,为口腔癌的早筛提供了一种新的诊断方法。二、实验方法1.本研究选取2021年10月-2022年10月于扬州大学附属医院口腔颌面外科就诊且资料完整的30例鳞状细胞癌患者及30例健康志愿者为研究对象。2.通过还原反应制备形状规则、粒径均一的六边形金纳米片。而后利用油水界面自组装方法得到六边形金纳米片阵列,在其表面修饰发夹DNA获得SERS捕获基底。同理通过电偶置换反应制备金银核壳,将拉曼信号分子和发夹DNA与金银核壳链接形成SERS探针。3.在目标miRNAs的存在下,添加SERS探针,HCR过程被触发并在捕获基底上形成长DNA杂交链。通过检测拉曼报告分子的SERS信号实现对miR-31和miR-21的定量检测。三、实验结果1.本研究未发现口腔鳞状细胞癌具有独特的SERS拉曼峰,但口腔鳞状细胞癌患者和健康人群的SERS强度存在差异,具有统计学意义(P0.05)。口腔鳞状细胞癌SERS强度明显增强,提示miR-21和miR-31表达异常。2.在10aM-10pM的线性范围内,磷酸盐缓冲液(PBS)中miR-31和miR-21的检测限分别为6.21 aM和6.29 aM。3.在10aM-10pM的线性范围内,唾液中miR-31和miR-21的检测限分别为6.51aM和6.52 aM。四、结论1.本研究证实不同临床分期的口腔鳞状细胞癌患者的SERS光谱特征无显著差异,而健康志愿者与癌症患者之间的SERS强度可见明显差异。2.本研究证实在实际应用中,SERS生物传感器和定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)的检测结果几乎一致。3.本研究证明该生物传感器能为口腔鳞状细胞癌的诊断提供一种更高效灵敏、更便捷、可靠的方法。