黄芪-莪术调控肠道菌群介导的胆汁酸代谢通路抗结肠癌组分筛选及作用机制研究

作     者：王旭 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐德才

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：结肠癌 黄芪-莪术 肠道菌群 胆汁酸 FXR TGR5 

摘      要：目的: 肠道菌群介导的胆汁酸代谢的改变在癌症的发生和发展中发挥作用。课题组前期研究结果表明,黄芪-莪术对结肠癌的生长及肝转移有明显的抑制作用,其作用机制与肠道菌群和肠道免疫相关。本课题在前期研究基础上对黄芪-莪术抗结肠癌物质基础和作用机制进一步深入探究。 方法: 1.本研究应用宏基因组学对黄芪-莪术干预前后结肠癌小鼠肠道微生物基因进行测序,对其中的差异基因进行京都基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,明确黄芪-莪术调节结肠癌小鼠肠道微生物群以及所介导的代谢通路。 2.为更直观展现黄芪-莪术调控的胆汁酸代谢通路,采用UHPLC-QTRAP-MS/MS检测黄芪-莪术干预前后结肠癌小鼠粪便中胆汁酸(BA)的水平,揭示黄芪-莪术参与结肠癌小鼠体内胆汁酸的代谢。 3.16S rRNA测序技术对黄芪-莪术干预前后结肠癌小鼠肠道细菌进行针对性测序。 4.应用UHPLC-MS/MS对所使用的黄芪-莪术水煎液各成分进行含量测定,明确黄芪-莪术主要活性成分在小鼠血清、心、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠、粪便和肿瘤中的分布情况。 5.基于分子对接技术,揭示黄芪-莪术中主要活性成分与胆汁酸下游核心靶点法尼醇X受体(FXR)和G蛋白胆汁酸偶联受体5(TGR5)结合活性,初步筛选黄芪-莪术中调节胆汁酸受体的主要活性成分。 6.黄芪-莪术药对中各组分(黄芪黄酮TFA、黄芪多糖APS、黄芪皂苷TAS和莪术油组分ZTO)干预结肠癌原位移植瘤小鼠,观察各组组小鼠肿瘤大小和组织病理切片,进一步筛选黄芪-莪术中药效最好的组分。 7.黄芪皂苷高剂量组(TAS-H)、莪术油高剂量组(ZTO-H)和黄芪皂苷+莪术油组(TAS+ZTO)给药后,LC-ESI-MS/MS(UHPLC-Qtrap)追踪各组小鼠粪便中胆汁酸的水平,Western-blot方法检测FXR和TGR5蛋白表达,验证黄芪-莪术中TAS和ZTO的组分配伍效果,及其通过激活FXR和TGR5,调节胆汁酸发挥抗结肠癌的作用。 结果: 1.宏基因组学鉴定出4471个与疾病状态显著相关的差异基因(p0.01),京都基因组百科全书(KEGG)通路富集分析结果显示,脂质代谢途径(Lipid metabolism pathway)在所有受黄芪-莪术调控的的代谢途径中高居第二,深入探究脂质代谢途径(Lipid metabolism pathway)内的差异基因,次级胆汁酸代谢途径(Secondary bile acid biosynthesis pathway)的显著排名,根据上述结果,明确肠道微生物调控的次级胆汁酸代谢通路是黄芪-莪术抗小鼠结肠癌的主要代谢通路,因此后续研究选择对黄芪-莪术调控肠道微生物-胆汁酸进行深入探讨。 ***-ESI-MS/MS(UHPLC-Qtrap)对黄芪-莪术干预前后结肠癌小鼠粪便样品中47种胆汁酸进行定性定量检测,结果表明,黄芪-莪术干预后显著回调结肠癌小鼠粪便中12种胆汁酸含量,显著下调结肠癌小鼠中α-鼠胆酸(α-MCA)、牛磺酸(TCA)、牛磺酸-α-鼠胆酸(Tα-MCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)和3-脱氢胆酸(3-DHCA)水平,显著升高牛磺酸(TCDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、猪胆酸(HCA)、ω-鼠胆酸(ω-MCA)、脱氢石胆酸(DLCA)和23-脱甲脱氧胆酸(23-NorDCA)水平。 3.16S rRNA测序结果表明,黄芪-莪术治疗后结肠癌小鼠粪便中有益菌Citro bacter和Candidatus＿Arthromitus丰度增加,有害菌Adlercreutzia、Anaerofustis、n orank＿f＿noranko＿Ostrospirales,Lachnospiraceae＿UCG-006、Muribaculum、LachospiraceaE＿UCG-001、NK4A214＿group、Parvibacter、norank＿f＿Eggerhell eae、Anaeroplasma、UBA1819和norank＿f＿norank＿o＿RF39的丰度显著下降 4.结合宏基因组学分析结果,对京都基因组百科全书(KEGG)官网找到次级胆汁酸合成途径的总计15个基因进行丰度检测,明确该代谢途径在结肠癌小鼠体内显著变化的的3个基因为FabG、baiA和baiB,比对NR数据库,发现这三个基因与33种不同的微生物密切相关,其中12种微生物有显著差异,使用宏基因组和16S rRNA测序方法测得的差异菌群用Venn图分析表明,Adlercreutzia和Parvibacter为差异性最显著菌属。 ***-MS/MS对黄芪-莪术水煎液及正常/结肠癌小鼠给药后主要活性成分组织分布结果显示,水煎液中含有的稳定化合物主要有槲皮素、毛蕊