抗黄曲霉毒素B1纳米抗体噬菌体展示文库构建及其检测技术研究

作     者：王新阳 

作者单位：佳木斯大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邵长利;孙铁强

授予年度：2023年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：纳米抗体 黄曲霉毒素B1 磁分离化学发光免疫分析 生物素/链霉亲和素定向偶联策略 侧流免疫层析 

摘      要：目的:黄曲霉毒素B（AFB）因其毒性和致癌性已被世界卫生组织癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物。由于缺乏有效的脱毒手段,食物链积累成为AFB威胁人类健康的主要途径。为确保食品安全,薄层色谱法、质谱法等分析方法常用于AFB检测。但该类方法存在样本前处复杂、操作步骤繁琐、检测耗时长等缺点,难以满足现场、即时检测分析的需求。因此,本研究致力于开发以纳米抗体为基础的AFB检测分析方法,以满足AFB现场检测的需求。方法:1.抗AFB纳米抗体噬菌体展示文库构建及VHH筛选。采用黄曲霉毒素B-牛血清白蛋白（AFB-BSA）完全抗原免疫健康双峰驼。以免疫双峰驼的外周血淋巴细胞为起始材料,设计简并引物,获取重链抗体基因片段,并以此为模板获取VHH基因片段。通过优化基因片段与质粒连接比例、电转化流程构建噬菌体展示VHH文库。利用噬菌体展示VHH筛选技术,通过逐轮递减抗原浓度、加大洗涤压力等筛选措施,有效富集特异性识别AFB的阳性克隆噬菌体。之后将VHH基因克隆进入质粒,重组质粒通过原核表达系统实现VHH的可溶性表达。将筛选VHH基因序列输入Rosstta DOCK软件进行计算机分子对接验证。2.基于筛选的特异性高亲和力VHH,开发快速、稳定的磁分离化学发光免疫检测分析法用于检测谷物及其制品中的AFB。设计引物调取大肠杆菌碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）基因片段,ALP基因片段与VHH基因片段通过柔性肽连接,克隆至表达质粒,经原核表达制备ALP-VHH融合蛋白。基于环氧基与巯基的开环反应,制备AFB-BSA修饰免疫磁珠。通过优化融合蛋白工作量、免疫磁珠粒径、反应时间、反应缓冲液酸碱度与盐离子浓度等检测条件提高检测分析灵敏度和稳定性。在最佳反应条件下,建立磁分离化学发光免疫检测法的竞争标准曲线,选择AFB结构类似物与功能类似物评估该方法特异性。最后选择玉米、燕麦等加标样本验证其实际样本检测分析能力。3.开发基于生物素/链霉亲和素（Avi/streptavidin,Avi/SA）定向偶联策略的纳米抗体侧流免疫层析试纸条（VHH-LFIA）用于检测AFB。通过酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）比对VHH与鼠抗AFB单克隆抗体（Mouse anti-AFB m Ab）的有机溶剂、酸碱度、温度等耐受性,以确保VHH在复杂检测环境条件下的抗干扰能力。设计引物将VHH基因片段与Avi Tag基因片段通过柔性肽拼接,克隆至表达质粒,经原核表达制备VHH-Avi Tag融合蛋白。将AFB-BSA完全抗原喷涂为试纸条检测线（Test line,T-line）,Biotin-BSA喷涂为试纸条质控线（Control line,C-line）制备检测试纸条。采用Avi/SA定向偶联策略,以量子点（Quantum dots,QDs）作为信号元件制备VHH-Avi/SA@QDs免疫检测探针,同时制备基于碳化二亚胺（EDC/NHS）随机偶联法的VHH@QDs免疫检测探针,比对二者检测分析能力。建立通过智能手机拍照的灰度比对信号输出策略。优化QDs粒径、T-line上AFB-BSA工作浓度、反应缓冲液酸碱度、反应缓冲液甲醇浓度、反应缓冲液吐温-20浓度等检测条件。从灰度比对定量分析与裸眼观察定性分析两个角度确定本方法的检测灵敏度与稳定性。在最佳反应条件下,建立VHH-LFIA竞争标准曲线,选择AFB结构类似物与功能类似物评估该方法特异性。为评估Avi/SA定向偶联策略的适用性,使用Au NPs作为信号元件替代QDs,制备VHH-Avi/SA@Au NPs免疫检测探针。通过加速老化实验评估VHH-LFIA稳定性,并与基于m Ab的商品化AFB检测试纸条进行甲醇、温度、盐离子耐受性比对。最后选择燕麦加标样本验证其实际样本检测分析能力。结果:1.成功构建噬菌体展示纳米抗体文库。实验结果显示:构建噬菌体展示纳米抗体文库,经计算库容量达到6×10～7 CFU/mL;同时经基因测序多样性分析,纳米抗体库具有良好的多样性。从纳米抗体库中成功筛选制备3株特异性抗AFB纳米抗体,分别命名为VHH、VHH、VHH。分别建立3种纳米抗体的标准曲线,实验结果表明VHH和VHH表现出对AFB的高灵敏度,半抑制浓度(IC)分别为0.969 ng/mL和1.349 ng/mL,线性范围分别为0.286～4.185 ng/mL和0.33～4.487 ng/mL;VHH灵敏度低于VHH和VHH,IC为4.069 ng/mL,但其线性范围更宽,为1.00～11.141ng/mL,可适用于开发应对不同浓度AFB限量标准的分析方法。分子对接结果表明,AFB位于VHH的CDR2和CDR3区域构成的活性口袋中;相互作用分析结果显示:AFB