PEGDA两亲性薄膜及干细胞治疗兔大泡性角膜病变的实验研究

作     者：方逸凡 

作者单位：中国人民解放军医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：黄一飞

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：大泡性角膜病变 角膜内皮细胞 胚胎干细胞 高分子薄膜 移植 

摘      要：研究背景角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)是位于角膜后弹力层上的六边形单层细胞,通过泵和屏障功能维持角膜正常的水合作用,进而维持角膜透明度和发挥正常视觉功能。人角膜内皮细胞不可再生,各种原因导致的角膜内皮的数量下降和功能异常会导致角膜水肿甚至视力下降,临床上称为大泡性角膜病变。角膜内皮移植是治疗大泡性角膜病变的唯一有效方式,但移植手术对手术技术要求较高,加之角膜内皮植片供体来源有限导致该手术难以大量开展。生物材料支架联合多能干细胞诱导分化是构建组织工程角膜内皮的核心目标,但目前缺乏合适的替代材料及高效的诱导方案成为制约角膜内皮疾病的关键科学问题。目的本研究旨在构建角膜内皮替代疗法治疗大泡性角膜病变,利用改良保留后弹力层的兔大泡性角膜病变模型,探究兔原代角膜内皮细胞及人胚胎干细胞诱导分化的角膜内皮样细胞前房注射治疗的有效性,绘制种子细胞的命运转归图谱;构建聚乙二醇(二醇)丙烯酸酯(PEGDA)两亲性薄膜,通过类内皮移植手术使其整合于角膜后部形成物理屏障,探究其治疗大泡性角膜病变的有效性。方法1.自主设计角膜内皮刮除器械,只刮除角膜内皮的同时保留后弹力层,构建改良式兔大泡性角膜病变模型;前房注射体外扩增的兔原代角膜内皮,通过裂隙灯照相、前节OCT评估及HE染色评估动物模型稳定性及原代角膜内皮细胞的治疗效果;2.定向诱导分化人H9胚胎干细胞为角膜内皮样细胞,前房注射治疗兔大泡性角膜病变,通过前节照相及裂隙灯观察其治疗效果,借助慢病毒转染荧光素酶报告基因,结合小动物活体成像及共聚焦显微镜动态观察种子细胞体内功能及命运转归;3.利用医用高分子材料聚乙二醇(二醇)丙烯酸酯(PEGDA)和甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)交联构建PEGDA两亲性薄膜,并通过聚乙烯吡咯烷酮(PVP)PVP使其一侧具有亲水属性,从而利于贴合于角膜后部;通过光镊及接触角测定其弹性及亲水性;通过Live/dead实验评价其生物相容性;将其移植到兔大泡性角膜病变模型内,通过裂隙灯照相,前节OCT,活体共聚焦显微镜,三维眼前节分析仪Pentacam评估其治疗效果及位置变化;进一步通过HE及PAS染色、扫描电镜观察其对角膜显微结构及超微结构的影响;最后通过眼压测量及房水炎症因子评估其体内的生物安全性。结果1.首先,我们得到了损伤可控、符合眼部解剖学特征和人体工效学的内皮刮除器械,借助该器械成功构建改良式兔大泡性角膜病变模型,台盼蓝染色示刮除范围均匀完整,HE及茜素红染色提示后弹力层贴合良好,角膜内皮被完全去除,刮除时间大幅缩短;获得功能良好原代角膜内皮种子细胞,于前房注射后第1d、4d、14d两组角膜厚度无统计学差异;注射原代内皮细胞(CEC组)在第7天时可达到临床治愈(角膜厚度500μm),各组角膜厚度间差异有统计学意义(P0.05)。14d后组织学观察CEC组角膜各层结构完整,基质纤维排列更为紧密,六边形内皮细胞形态规则;2.利用模拟发育生物学过程诱导胚胎干细胞至角膜内皮样细胞,前房注射后ES-CEC组与CON组角膜恢复透明速度大致相同,具有一定的内皮细胞功能,小动物活体成像结果提示该种子细胞在兔体内存活可达49d以上;3.利用不同比例的预混液我们得到了不同厚度的具有透明性的透明可折叠PEGDA两亲性薄膜,PVP处理后接触角显著减小,亲水特性增加;体外Live/dead结果显示类似于普通细胞培养板培养条件;移植入兔大泡性角膜病变动物模型体内可以牢固贴合于角膜后弹力层,4-7d时即可使水肿角膜恢复至正常厚度且透明;HE及PAS染色提示其角膜基质排列致密,炎症反应较轻;SEM结果显示薄膜与角膜贴合良好,周边内皮细胞功能正常但迁移至薄膜表面生长;眼压及房水炎症因子提示其植入后眼压短期升高,长期处于稳定正常状态;房水中炎症因子IL-1β,TNF-α,s ICAM与Sham组相比无统计学差异,提示材料具有良好的生物安全性。结论本研究首先成功构建了改良式保留后弹力层的兔大泡性角膜病变动物模型;发现前房注射兔原代角膜内皮细胞的治疗兔大泡性角膜病变有效;进而验证人胚胎干细胞诱导分化的角膜内皮样细胞对大泡性角膜病变有一定治疗效果,种子细胞可在动物眼内稳定存活并增殖49d;最后成功构建两亲性PEGDA膜,可以牢固贴合于角膜后表面,作为物理屏障替代角膜内皮,治疗兔大泡性角膜病变效果确切。