Ambra1调控乳腺癌细胞侵袭、迁移及机制的研究

作     者：何玲燕 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙蔚亮

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：乳腺癌 Ambra1 上皮-间质转化 迁移 侵袭 

摘      要：目的和意义:目的:明确Ambra1对乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞侵袭、迁移的调控作用及可能的机制。意义:通过本研究可以发现一种新的乳腺癌细胞侵袭迁移的调控机制,为乳腺癌治疗提供新的靶点。方法:通过慢病毒包装的sh RNA-AMBRA1(LV-sh RNA-AMBRA1)沉默乳腺癌细胞中的AMBRA1基因,LV-sh RNA-NC作为对照组。在分别转染LVsh RNA-AMBRA1或LV-sh RNA-NC 72 h后,筛选稳定低表达Ambra1的细胞株,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(western blot,WB)分别检测AMBRA1 m RNA的表达水平和Ambra1蛋白的表达,用以检测Ambra1的敲降效率。随后,应用划痕愈合实验和Transwell迁移实验分别检测细胞的迁移能力,应用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。最后,用WB分别检测EMT相关蛋白和Src/FAK通路相关蛋白的表达水平。结果:***值的确定:当MOI=10时,LV-sh RNA-AMBRA1或LV-sh RNANC转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,72 h后于荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达,细胞荧光效率90%,因此,在后续研究中,使用MOI=10转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。同理,在乳腺癌MCF-7细胞中,当MOI=20时,细胞荧光效率90%,因此,在后续研究中,使用MOI=20转染乳腺癌MCF-7细胞。2.稳定低表达Ambra1细胞株的筛选及检测:将LV-sh RNA-AMBRA1和LV-sh RNA-NC转染至乳腺癌细胞后,分别用q RT-PCR技术和WB实验检测细胞内AMBRA1基因和Ambra1蛋白的表达。q RT-PCR检测结果显示:231-sh RNA-AMBRA1组中AMBRA1 m RNA的相对表达水平明显低于231-sh RNA-NC组和空白对照组(P0.05),敲低效率达63%,达到实验要求。在乳腺癌MCF-7细胞中,MCF-7-sh RNA-AMBRA1组中AMBRA1 m RNA的相对表达水平明显低于MCF-7-sh RNA-NC组和空白对照组(P0.05),敲低效率达69%,达到实验要求。在WB实验中,可发现231-sh RNAAMBRA1组Ambra1的蛋白相对表达量明显低于231-sh RNA-NC组和空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。在乳腺癌MCF-7细胞中,MCF-7-sh RNA-AMBRA1组Ambra1的蛋白相对表达量明显低于MCF-7-sh RNA-NC组和空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。综上提示,已经成功构建稳定低表达Ambra1的乳腺癌细胞株。3.细胞迁移能力的检测:通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力。在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,划痕愈合实验结果显示,231-sh RNA-AMBRA1组的划痕愈合率明显低于231-sh RNA-NC组和空白对照组(P0.05)。Transwell迁移实验检测发现,231-sh RNA-AMBRA1组穿过膜的乳腺癌细胞数明显低于231-sh RNA-NC组和空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。在乳腺癌MCF-7细胞中,划痕愈合实验结果显示,MCF-7-sh RNA-AMBRA1组的划痕愈合宽度变化明显低于MCF-7-sh RNANC组和空白对照组(P0.05)。Transwell迁移实验检测发现,MCF-7-sh RNA-AMBRA1组穿过膜的细胞数明显低于MCF-7-sh RNA-NC组和空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。以上数据结果说明Ambra1的敲降能显著抑制乳腺癌细胞的迁移能力。4.细胞侵袭能力的检测:在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,结果显示,231-sh RNA-AMBRA1组的跨膜细胞数显著低于231-sh RNA-NC组和空白对照组(P0.05)。同理,在乳腺癌MCF-7细胞中,MCF-7-sh RNAAMBRA1组的跨膜细胞数明显低于MCF-7-sh RNA-NC组和空白对照组(P0.05)。这说明Ambra1的敲降显著抑制了乳腺癌细胞的侵袭能力。5.上皮-间充质转化(EMT)及通路相关蛋白表达的检测:实验结果表明,在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,231-sh RNA-AMBRA1组中Snail、Vimentin、p-Src和p-FAK等蛋白的相对表达水平明显低于231-sh RNA-NC组和空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05);而E-cadherin蛋白的相对表达水平明显高于231-sh RNA-NC组和空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。在乳腺癌M