SphK1介导LPS所致的急性肺损伤的作用机制

作     者：韦朝顺 

作者单位：吉首大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王小莉

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：鞘氨醇激酶1(SphK1) 脂多糖(LPS) 急性肺损伤(ALI) 急性呼吸窘迫综合征(ARDS) PI3K/AKT信号通路 

摘      要：急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一种包括病毒性或细菌性肺炎、败血症以及机械通气机引起的创伤等多种肺内外因素引起的严重呼吸系统疾病。其发病率逐年递增,病死率高,但临床上并无较好的药物和治疗靶点,使其治疗较为困难。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)作为一种炎症介质,可磷酸化鞘氨醇生成鞘氨醇1磷酸(sphingosine 1 phosphate,S1P),并通过磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphoinositide 3-kinase/serine/threonine kinase,PI3K/AKT)信号通路参与炎症反应、氧化应激损伤和细胞增殖及迁移等过程,在许多炎症疾病和肿瘤中起作用。然而SphK1在LPS所致的ALI炎症反应中扮演何种角色、涉及哪些分子、具体机制如何,目前尚不清楚,是否可以通过促进S1P的释放,调控PI3K/AKT信号通路介导炎症因子和炎症介质的释放促进LPS所致的ALI炎症反应是未知的,国内外相关研究较少。基于文献分析和前期基础提出假说:在ALI时,SphK1异常活化,并通过S1P的释放调控PI3K/AKT信号通路活性,通过基质金属蛋白酶类、炎症介质和炎症因子的释放,参与并促进ALI炎症反应。对于这个假说的探讨,将进一步加深对ALI炎症机制的理解。深入研究SphK1与PI3K/AKT信号通路的关系对于治疗ALI具有重要的意义,为治疗ALI提供新的靶点和策略。研究目的:通过研究SphK1对急性肺损伤中炎症信号通路的调控、相关炎症因子的释放和表达以及细胞生物学功能的变化的影响,深入揭示SphK1在急性肺损伤中对炎症的影响及其机制,为急性肺损伤的治疗提供新的思路和实验数据。研究方法:(1)在动物实验上,BALB/c小鼠经腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(10 mg/kg体重)构建ALI小鼠模型。对照组和对照组+DMS组注射LPS等量的生理盐水前三天灌胃或不灌胃SphK1特异性抑制剂N,N-二甲基鞘氨醇(N,N-dimethylsphingosine,DMS);ALI组和ALI+DMS组在注射LPS前3天灌胃或不灌胃DMS。抑制SphK1后,观察小鼠肺组织湿干重(wet/dry,W/D)比率、炎症评分和小鼠生存率、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和超氧化物酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量等的变化情况。采用ELISA法检测小鼠支气管肺泡灌洗液和血清中TNF-α和IL-6炎症因子表达变化情况。(2)在细胞水平上,在RAW264.7细胞中加入1μg/m L LPS,构建ALI细胞体外模型。并采用慢病毒过表达技术过表达SphK1后,采用CCK-8法观察对RAW264.7细胞的增殖/抑制情况;ELISA法检测细胞上清液中的炎症因子TNF-α和IL-1β蛋白水平;RT-q PCR检测细胞上清液炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 m RNA水平;Western Blot法检测PI3K/AKT信号通路蛋白水平;ELISA和RT-q PCR方法检测PI3K/AKT信号通路下游信号分子MCP-1、MMP-2和MMP-9表达的变化情况。探究SphK1在LPS诱导的ALI炎症反应中的作用及可能的机制。结果:(1)采用DMS抑制剂可以明显改善ALI小鼠的生存率,降低ALI炎症评分,降低小鼠肺W/D比率,减轻ALI小鼠形态学损伤,升高SOD活性并降低MPO的活性和MDA含量及炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平(p0.01)。(2)利用慢病毒过表达技术对SphK1进行过表达处理,可以促进RAW264.7细胞伪足数目的增加及细胞的分化,增强细胞的粘附能力,提高TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA水平和TNF-α和IL-1β蛋白水平,提高MCP-1和MMP-2m RNA水平和MMP-2和MMP-9蛋白水平的表达(p0.01)。(3)利用慢病毒过表达技术对SphK1进行过表达处理,可以促进RAW264.7细胞中S1P的表达(p0.01),下调p-PI3K85/PI3K 85、PI3K 110和p-AKT/AKT蛋白水平的表达(p0.01)。结论:(1)在ALI引起的炎症反应和氧化应激中,SphK1发挥着重要的作用。抑制SphK1的表达可减轻ALI引起的炎症反应和氧化应激损伤。(2)过表达SphK1可以促进炎症因子的释放,并通过促进S1P的产生使PI3K/AKT信号通路受到抑制,并通过基质金属蛋白酶类和炎症介质的释放,促进A