CSF2RB过表达提高静脉注射间充质干细胞的心肌保护作用和机制

作     者：齐婷婷 

作者单位：中国人民解放军空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范延红;闫文俊

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：间充质干细胞 静脉注射 心肌缺血损伤 CSF2RB RNF4 

摘      要：[研究背景]缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)是当今社会上最具威胁性的疾病,占世界总死亡人数的16%,严重影响了人类的健康与生活。目前全球医疗界普遍认同的治疗手段主要有外科冠状动脉搭桥手术、内科经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention,PCI)以及药物治疗等。虽然这些治疗手段能够有效改善心脏功能,减缓IHD的进展,但是IHD患者心梗后心衰的发病率仍然居高不下,其生活质量依旧堪忧。因此,如何延缓或预防心衰的发生和发展,成为了亟待解决的关键问题。干细胞移植治疗可减少心肌细胞凋亡、减轻心肌纤维化、改善心肌重塑,是IHD治疗的潜在策略。诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和间充质干细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)是目前应用于基础和临床研究中治疗IHD的主要干细胞类型。与其他干细胞类型相比,MSCs具有易获得、低免疫原性、无伦理问题、无致瘤性等优势,有望成为治疗IHD的理想候选细胞。多年来,干细胞研究领域已经尝试了多种干细胞移植方式,如冠状动脉内注射、静脉注射和心肌内注射。相比于其他注射方式,静脉注射具有可重复、无创、易于操作的突出优势。多项临床试验发现,MSCs移植治疗IHD是安全可行的,不会增加患者的不良事件发生率,并且有助于改善患者心脏功能、延缓心室重构,但是对心衰发生率和死亡率的改善作用并不显著。临床治疗效果不佳主要是由于MSCs移植后心脏归巢少、成活率低、缺乏心肌细胞分化能力和旁分泌不足等因素导致。因此寻求新的方法提高MSCs移植后的数量及存活率,是增强MSCs防治心梗后心衰的重要策略。集落刺激因子2(colony-stimulating factor 2,CSF2),又称粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor,GM-CSF),是一种能够在体外促进骨髓前体细胞向单核细胞和巨噬细胞分化的生长因子。我们前期研究发现,梗死心肌中趋化因子CSF2表达和释放水平显著升高,这种因子可以与脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell,ADSC)上的 CSF2 受体 β 亚基(colony stimulatingfactor2receptorbetasubunit,CSF2RB)发生作用,促进静脉注射ADSC向心脏归巢。然而,ADSC中CSF2RB表达量极低,药物手段提高ADSC中CSF2RB表达的作用有限。为了解决这个问题,我们构建CSF2RB腺病毒载体,并将其转染到ADSC中,成功提高了 ADSC中CSF2RB的表达水平,以研究CSF2RB过表达对静脉注射ADSC心脏归巢和心肌保护作用的影响,并探讨其细胞学和分子学机制。[研究目的]1.验证多次静脉注射ADSC对小鼠心肌缺血损伤的影响;2.检测成功行PCI的急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者与非冠心病对照组受试者血浆CSF2水平;比较缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)模型小鼠和Sham组小鼠血浆及心肌组织中CSF2蛋白水平变化;3.阐明过表达CSF2RB对ADSC心脏归巢及心肌修复的影响;4.探讨过表达CSF2RB对ADSC迁移、凋亡和旁分泌的影响及分子机制。[研究方法]1.为验证多次静脉注射ADSC对小鼠心肌缺血损伤的影响,首先通过冠状动脉结扎术构建MI/R小鼠模型,并随机分为以下三组:假手术组(Sham组),行缺血再灌注手术后静脉注射无细胞媒介组(MI/R+Vehicle组)和行缺血再灌注手术后静脉注射ADSC组(MI/R+ADSC组)。自MI/R术后3天起,MI/R+ADSC组小鼠接受3周内共7次静脉注射td Tomato标记的ADSC,MI/R+Vehicle组小鼠接受3周内共7次静脉注射同等体积的无细胞媒介。在MI/R术后3周利用免疫荧光技术检测小鼠心脏、肺脏、肝脏和脾脏组织中td Tomato标记的ADSC数量以及心肌组织新生血管密度,心脏超声检测小鼠心脏功能,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediateddNTP nick-endlabeling,TUNEL)染色检测心肌细胞凋亡。在 MI/R术后6周,利用心脏超声检测小鼠心脏功能,Masson三色染色检测心肌纤维化面积,实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测心衰指标心房钠尿肽(Atri