ISKNV介导Rac1-PAK1-LIMK-Cofilin信号通路调控F-actin重排促进自身复制增殖

作     者：谭有燕 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：付小哲

授予年度：2023年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：传染性脾肾坏死病毒 F-actin Rac1-PAK1-LIMK-Cofilin信号通路 调控 复制增殖 

摘      要：传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)可感染多种鱼类,是造成鳜发病的主要病原之一,严重危害鳜养殖业的健康发展。微丝(F-actin)是细胞骨架的重要组成成分,在病毒吸附、入侵及组装和释放过程中发挥重要作用。有研究发现F-actin在ISKNV感染晚期具有重要作用。那么F-actin与ISKNV复制增殖存在什么关系?参与调控F-actin的信号通路有哪些?它们又怎样调控ISKNV复制增殖?带着上述问题,我们开展如下研究:1.F-actin与ISKNV复制增殖的关系ISKNV感染鳜脑细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB),RT-q PCR检测ISKNV不同时间点拷贝数变化,结果显示ISKNV感染72 h是病毒复制的高峰期。在此时间段对细胞F-actin间接免疫荧光染色,与对照细胞相比,ISKNV感染后的F-actin聚集在病毒的病变位置,说明ISKNV的复制增殖会导致F-actin发生重排。利用F-actin抑制剂Cytochalasin D和Cucurbitacin E预处理细胞,抑制F-actin重排,RT-q PCR、Western blot和TCID检测其对ISKNV复制增殖的影响。结果显示抑制F-actin重排后,ISKNV的病变细胞、病毒基因组拷贝数和病毒蛋白表达呈剂量依赖性下调,病毒滴度降低。上述结果说明,ISKNV诱导F-actin重排促进病毒的复制增殖。*** A-Rock 1和Rac1-PAK1信号通路与ISKNV复制增殖的关系F-actin是高度动态变化的结构,由Rho GTPases家族成员通过传递膜受体信号调控。Rho A及Rac1是Rho-GTPase家族主要成员。为了探究Rho A和Rac1及其下游信号通路是否参与ISKNV的感染,RT-q PCR和Western blot对病毒感染72 h后细胞内的Rho A、Rock 1、Rac1、PAK1进行测定。RT-q PCR发现病毒感染72 h的Rho A、Rock 1、Rac1及PAK1 m RNA上调;Western blot结果显示,病毒感染72 h的Rho A、Rock 1、Rac1及PAK1蛋白表达显著上调,PAK1的磷酸化显著上调,说明Rho A-Rock 1和Rac1-PAK1信号通路均参与了ISKNV复制增殖。为了进一步阐释Rho A-Rock 1和Rac1-PAK1通路与ISKNV复制增殖的关系,利用抑制剂CCG-1423、Thiazovivin、Ehop-016和IPA-3分别抑制Rho A-Rock 1和Rac1-PAK1通路。RT-q PCR发现抑制Rho A-Rock 1通路后ISKNV基因组D NA拷贝数降低2.4倍,ISKNV引起的细胞病变减少2.3倍,以上结果说明抑制R ho A-Rock 1通路后抑制ISKNV复制增殖。抑制Rac1-PAK1通路后,ISKNV基因组DNA拷贝数降低4.3倍,ISKNV引起的细胞病变减少5.8倍,ISKNV-MCP蛋白表达下调3.4倍,说明抑制Rac1-PAK1通路显著抑制ISKNV的复制增殖。对抑制剂Ehop-016和IPA-3处理后的细胞进行荧光染色,发现抑制剂抑制病毒诱发的F-actin重排,说明在ISKNV复制增殖中,Rac1-PAK1信号通路调控F-actin重排。综上,抑制Rho A-Rock 1和Rac1-PAK1通路均可抑制ISKNV复制增殖,但Rac1-PAK1通路对ISKNV的复制增殖影响更显著,因此本实验后续主要以Rac1-PAK1为研究对象。***-Cofilin信号通路与ISKNV复制增殖的关系LIMK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员,是PAK1下游激酶。RT-q PC R和Western blot检测LIMK在ISKNV复制增殖过程中的激活情况及对病毒复制增殖的影响。结果显示ISKNV感染细胞72 h后,细胞LIMK m RNA表达、LIM K蛋白表达及磷酸化的LIMK蛋白表达均显著上调,LIMK活性明显上调,这与P AK1的变化趋势相一致。si RNA敲降细胞内源性LIMK基因后,RT-q PCR和We stern blot检测ISKNV感染量的变化,结果显示ISKNV的复制增殖被明显抑制,表明ISKNV介导LIMK调控病毒复制增殖。LIMK可调控其下游激酶Cofilin使其磷酸化而失活。利用RT-q PCR和Weste rn blot检测ISKNV感染后Cofilin激活情况,结果显示ISKNV感染细胞72 h后,胞内Cofilin m RNA表达显著上调,Cofilin蛋白表达显著上调,磷酸化的Cofilin蛋白表达显著下调,