荚膜多糖合成基因capC对海假交替单胞菌生物被膜形成及厚壳贻贝附着与变态的影响
作者单位：上海海洋大学
学位级别：硕士
导师姓名：杨金龙
授予年度：2023年
学科分类：07[理学] 070703[理学-海洋生物学] 0707[理学-海洋科学]
主 题：荚膜多糖 capC基因 海假交替单胞菌 生物被膜 厚壳贻贝 附着
摘 要：厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是一种典型的大型海洋污损生物,研究其附着和变态机制对大型海洋生物污损的防治工作具有重要的生态意义及经济意义。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)作为海洋中广泛存在的一类细菌种属,其中大多数菌株形成的细菌生物被膜被证实可定向诱导海洋无脊椎动物幼虫的附着和变态。根据本实验室的研究,已知生物被膜的胞外产物如多糖、蛋白质、脂质等对厚壳贻贝幼虫变态及稚贝二次附着均具有一定诱导作用,其中胞外多糖如藻酸盐、可拉酸、纤维素对生物被膜及幼虫变态均有不同影响,而脂多糖合成基因缺失则被证明可显著降低生物被膜对稚贝二次附着的诱导效果。以往的研究结果表明荚膜多糖可通过促进细菌细胞间和细菌与基质之间的附着使形成的生物被膜上细菌更加聚集。但荚膜多糖对于海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)形成的生物被膜是否存在同样的影响及其可能通过何种分子机制影响生物被膜的形成、形成的生物被膜是否对厚壳贻贝幼虫变态或稚贝二次附着具有诱导效果的影响等问题目前尚不明晰。本文主要通过构建荚膜多糖合成调节基因capC缺失型菌株等方式探讨荚膜多糖对P.marina生物被膜及幼虫附着变态、稚贝二次附着的影响,得出以下结论:1.P.marina荚膜多糖合成调控基因capC缺失突变体形成的生物被膜上胞外多糖含量下降,经生物被膜诱导的厚壳贻贝幼虫附着变态率及稚贝附着率显著下降。为研究荚膜多糖合成基因对细菌生物被膜形成的影响,构建了ΔcapC菌株,并与P.marina菌株进行比较分析,结果表明capC基因的缺失没有使得P.marina菌株的表型发生明显的变化,在比较二者生长曲线时发现,进入平台期后菌株的生长并未受到影响;同时ΔcapC的运动性也并未出现显著变化,但菌株产生荚膜多糖的能力下降了38.07%,而胞内第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)水平升高1.94倍。利用两株细菌形成生物被膜,并对两者进行相关生物学特性观察与分析,结果表明:capC基因缺失后生物被膜的细菌密度、膜厚未发生显著变化,但相较于野生型P.marina菌株,ΔcapC菌株形成的生物被膜胞外多糖中α多糖下降了35.93%,β多糖下降了36.85%。经分光光度法检测多糖类物质含量发现生物被膜中可拉酸和藻酸盐含量分别下降了20.55%和22.25%,而脂多糖的含量则没有表现出显著性变化。利用ΔcapC形成的生物被膜诱导厚壳贻贝幼虫及稚贝发现其相较于野生菌诱导活性均显著下降。因此,荚膜多糖合成调控基因capC的缺失会减少细菌荚膜多糖的合成,调控了胞内c-di-GMP的分泌水平,同时影响生物被膜胞外产物的含量和生物被膜对厚壳贻贝幼虫附着变态及稚贝二次附着的诱导活性。2.荚膜多糖对ΔcapC菌株生物被膜形成及厚壳贻贝稚贝二次附着的影响本研究中对P.marina的胞外多糖和荚膜多糖分别进行提取,并分别检测了两者对厚壳贻贝稚贝二次附着的直接诱导活性。实验表明,胞外多糖对稚贝二次附着的影响存在阈值,整体趋势呈先上升后下降;而荚膜多糖对厚壳贻贝的稚贝二次附着相较于胞外多糖诱导活性较低,但当添加荚膜多糖溶液浓度达到50 mg/L时,表现出的诱导效果与添加浓度为0.5 mg/L时没有显著差异。为探讨荚膜多糖在生物被膜形成和稚贝二次附着的分子机制,在ΔcapC形成生物被膜的过程中添加提取自P.marina菌株的荚膜多糖,并对生物被膜的生物学特性进行观察与分析。结果显示,ΔcapC形成生物被膜的过程中添加荚膜多糖溶液浓度达到0.5 mg/L时,能够恢复生物被膜对稚贝二次附着的诱导能力,同时胞外多糖的生物量也恢复到了与野生菌相同的水平。同时根据定量分析发现,该基因的缺失导致生物被膜上可拉酸含量降低,在回补了浓度为0.5 mg/L的荚膜多糖溶液时,生物被膜上可拉酸含量水平恢复到了与野生菌同一水平。因此推测荚膜多糖可以促进生物被膜胞外多糖可拉酸的增加,提高生物被膜对稚贝二次附着的诱导能力。综上所述,capC突变菌株的荚膜多糖合成量减少,c-di-GMP水平上升,胞外多糖含量减少,对厚壳贻贝的幼虫附着变态及稚贝二次附着两种生理过程的诱导均显著下降。而添加提取自P.marina菌株的荚膜多糖可以使得突变菌株的胞外多糖生产能力恢复同时其诱导能力也能恢复到野生菌水平,表明荚膜多糖可以通过促进生物被膜胞外多糖可拉酸的产生诱导稚贝二次附着。
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