鮸鱼Smyd3调控TAK1介导免疫反应的分子机制研究
作者单位：上海海洋大学
学位级别：硕士
导师姓名：徐田军
授予年度：2023年
主 题：鮸鱼 Smyd3 TAK1 先天免疫系统 NF-κB
摘 要：鮸鱼(Miichthys miiuy)是一种重要的水产经济鱼类,在水产养殖中十分受到养殖户的喜爱,随着越来越多的人开始养殖鮸鱼,鮸鱼病害的问题也越来越严重,这些鱼病的发生不仅阻碍了鮸鱼的正常生长,而且还会给养殖户们造成的经济损失。因此,为了减少病害对鱼类造成的损失,就需要深入研究鱼类的免疫系统,提高鱼类对病原菌或是病毒的免疫力,从而提高养殖户的养殖效益,从根源上解决病害对养殖业造成的危害。本文研究的是鮸鱼的先天免疫系统,先天免疫系统的细胞识别并非特异性地作用于病原体。与后天免疫系统不同,先天免疫系统不能提供持久的保护性免疫力,但在所有动植物中都有快速抗感染作用。先天免疫系统也是宿主抵御病原体的第一道防线。先天免疫系统包括三种模式识别受体(PRRs):TLR、NLR和RLR。TLR信号转导包括5种接头蛋白:Myd88、MAL、TRIF、TRAM和SARM。除了TLR3以外,所有的信号转导都能够通过Myd88进行传递。在Myd88接受到信号后,他能够招募IRAKs,其中包括两个活性激酶IRAK1和IRAK4,两个非催化亚基IRAK2和IRAKM。IRAK1被磷酸化后,能够发出信号,与TRAF6形成复合物,并降解IκB,进而激活NF-κB。在先天性免疫中,TAK1在NF-κB通路中扮演重要角色。研究TAK1与其相关的调控蛋白Smyd3(SET and MYND domain containing 3)的作用方式具有重要的研究意义。本文研究了Smyd3能够通过抑制TAK1的表达从而减弱下游NF-κB的表达,即Smyd3能够在蛋白层面降解TAK1,从而抑制下游的NF-κB的产生。本研究结论如下:1.通过双荧光酶素实验发现Smyd3的过表达会抑制NF-κB信号通路中下游炎症因子的转录。并且在加入TAK1和LPS刺激后,报告基因明显被激活,Smyd3的加入仍然会抑制报告基因。2.通过q RT-PCR实验发现Smyd3能够在m RNA层面抑制下游炎症因子的表达,同时通过RNA干扰实验发现,Smyd3的表达被抑制后,下游炎症因子的表达会上升。3.由于NF-κB的激活需要TAK1的介导,所以本文还验证了Smyd3是否靶向TAK1从而调控NF-κB信号通路。双荧光酶素实验表明,Smyd3能够减弱TAK1介导的NF-κB信号通路,并且随着Smyd3浓度的提升,对于TAK1介导的NF-κB信号通路的抑制作用也上升。4.上述研究发现Smyd3能够抑制TAK1介导的NF-κB信号通路后,继续研究Smyd3蛋白与TAK1蛋白之间的关系。通过蛋白免疫印迹实验发现Smyd3的过表达能够使TAK1降解,并且随着Smyd3浓度的上升以及转染时间的增加,TAK1的表达量也随之下降。5.通过免疫共沉淀实验,发现Smyd3能够直接与TAK1发生互作,从而影响TAK1蛋白的表达。6.为了进一步研究Smyd3与TAK1互作的结构域,通过smart软件预测TAK1的结构域,并且设计引物使其结构域突变,结果发现Smyd3与TAK1的STK结构域发生互作。7.使用蛋白酶体抑制剂(MG132)、自噬抑制剂(3-MA)和溶酶体抑制剂(NHCl)处理转染TAK1和Smyd3的细胞或是转染Smyd3的鮸鱼细胞,发现不论是外源性还是内源性,MG132都能够抑制TAK1的降解。上述实验初步判断Smyd3是通过蛋白酶体途径促使TAK1降解。8.为了进一步研究TAK1的降解的分子机制,将TAK1、Smyd3以及泛素质粒(ubiquitin,Ub)转染进HEK293细胞中,并且通过蛋白免疫印迹发现Smyd3能够促进TAK1的泛素化。为了具体研究TAK1泛素化的位点,实验将赖氨酸48位点突变(K48-Ub)以及赖氨酸63位点突变(K63-Ub)转染进HEK293中,结果显示Smyd3能够促进TAK1 K48位点的泛素化。9.构建了甲基化转移酶失活突变体Smyd3-F188A,结果显示Smyd3不依赖其甲基化转移酶活性促进TAK1 K48连接的泛素化水平从而抑制TAK1介导的抑制NF-κB信号通路的转导。综上所述,Smyd3能够抑制NF-κB信号通路的转导,通过靶向TAK1并且与其结合从而使TAK1发生K48位点的泛素化,抑制NF-κB信号通路的转导,使其下游炎症因子如IL-8和IL-1β的表达。本论文为硬骨鱼的先天免疫系统的研究提供了新的数据,不仅弥补了Smyd3在鱼类先天免疫系统中的空白,而且还丰富了硬骨鱼中NF-κB信号通路的研究内容,这些数据也能为今后对哺乳动物的先天性免疫研究提供参考。
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