基于人工小RNA的多基因调控系统的构建及解析

作     者：张芬芳 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈磊;刘璐

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：大肠杆菌 人工小RNA 多基因调控 必需通路抑制 光遗传系统 

摘      要：细菌小RNA是一类长度在50～300 bp且通常不具备翻译能力的功能分子,在环境胁迫响应、代谢变化适应和细菌毒力控制过程中发挥着不可替代的调控作用。近年来,基于天然小RNA设计构建的人工小RNA的工作日益丰富,实现了对目的基因甚至通路的有效调控。人工小RNA工具通过与靶m RNA进行碱基互补配对而实现转录后调控,其中基于Hfq的人工小RNA抑制工具,由结合模块和Scaffold模块组成,对靶基因抑制时只需将结合模块设计成一段24 nt的与靶m RNA互补配对的序列,具有设计方便、易于实现、普适性好、抑制效率高等优势,在代谢工程上应用广泛。但在多基因调控方面,面对复杂的细胞网络,经常需要同时对多个基因进行调控,目前常使用多质粒或多启动子策略,但限于相容性质粒的数量或多启动子的重复序列,使小RNA应用于多基因调控的数量有限,目前还缺乏一种简单有效、调控范围更广的基于小RNA的多基因抑制工具。为此,本文以大肠杆菌MG1655为例,探索并解析了多基因调控的小RNA工具。本文完成了以下内容:1、在大肠杆菌MG1655中开发了多种基于Hfq的人工小RNA多基因抑制系统,通过比较我们确定了一种新的ZL-s RNA多基因抑制系统有较好的同时抑制率和质粒稳定性。该ZL-s RNA多基因抑制系统由一个启动子表达多个直接串联的小RNA,模块简单,构建方便,并达到了对5个基因平均72.46%的同时抑制率,以及对10个基因平均45.75%的同时抑制率。2、通过体外实验和体内实验初步探究了ZL-s RNA多基因抑制系统发挥功能的机制,验证了s RNA的Scaffold中Rho因子非依赖性转录终止子的存在使得ZL-s RNA多基因抑制系统转录出含不同个数s RNA的转录本。这也使得在ZL-s RNA中处于不同位置的s RNA对其靶基因的抑制效果不同,为实现多基因精细调控提供了研究方向。3、将ZL-s RNA多基因抑制系统与光遗传系统结合,初步开发了ZL-s RNA多基因光遗传抑制系统,实现光诱导条件下对多基因的抑制,实现了对5个基因达到平均22.79%的同时抑制率。并对影响s RNA抑制效果的因素进行分析,对进一步开发高效的光诱导多基因调控工具具有参考价值。本工作开发的基于人工小RNA工具的多基因调控系统ZL-s RNA具有模块简单稳定、抑制效果好的特点,并从机制上解释了通过改变s RNA的位置以实现ZL-s RNA用于多基因精细调控的可能。这项工作将为多基因调控工具提供了重要参考。