黄芩苷对坏死性凋亡的抑制作用及其机制研究

作     者：黄媛婷 

作者单位：暨南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何贤辉

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：坏死性凋亡 巨噬细胞 黄芩苷 p-MLKL寡聚化 ROS 

摘      要：目的:坏死性凋亡(Necroptosis)是一种受到受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)和混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)等信号分子调控的炎症性细胞死亡形式。虽然坏死性凋亡在宿主抵抗病原体感染方面具有重要生理作用,但它也与各种炎症性疾病的发生和发展息息相关,是治疗这些疾病的潜在靶点。黄芩苷是从唇形科植物黄芩的根中分离提取的黄酮类化合物,具有保肝、抗氧化、抗菌、抗病毒和抗炎等广泛的药理活性。以往的研究已证明黄芩苷能够有效抑制细胞焦亡,但目前对黄芩苷是否能够抑制细胞发生坏死性凋亡并减轻坏死性凋亡相关的炎症性疾病尚不清楚。本论文旨在探索黄芩苷对坏死性凋亡的影响及其作用机制,并研究其对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎(一种坏死性凋亡相关疾病的动物模型)的影响,为黄芩苷在治疗坏死性凋亡相关炎症性疾病中的应用提供实验依据。方法:(1)细胞培养和处理:J774A.1小鼠巨噬细胞系用DMEM完全培养基,在37℃,含5%CO培养箱中培养;骨髓源性巨噬细胞(BMDM)取自小鼠后股骨的骨髓细胞,在含L929细胞培养上清的特定培养基中培养6天,诱导分化而成。巨噬细胞以LPS和IDN-6556(Pan-caspase抑制剂)或TNF-α联合LCL-161(Smac模拟物)和IDN-6556处理诱导坏死性凋亡。(2)裂解性细胞死亡的鉴定:用含2μg/m L碘化丙锭(PI)和5μg/m L Hoechst 33342的PBS溶液染色10 min,然后用倒置荧光显微镜观察。(3)蛋白表达水平的分析:用免疫印迹法检测细胞裂解物中RIPK3、MLKL、p-RIPK3、p-MLKL以及细胞培养上清中HMGB1等蛋白的表达水平。(4)线粒体活性氧(ROS)水平的测量:用线粒体超氧化物检测试剂Mito SOX Red染色,然后用倒置荧光显微镜观察细胞中Mito SOX的荧光强度并拍摄记录。(5)线粒体膜电位的测量:以线粒体膜电位检测试剂盒(TMRE)进行检测,用倒置荧光显微镜观察细胞内TMRE的荧光强度并拍摄记录。(6)小鼠急性胰腺炎的诱导:小鼠提前一天以黄芩苷(200 mg/kg体重)或溶剂(含2%Tween-80的PBS)灌胃。经过禁食12 h但不禁水之后,腹腔注射雨蛙素(50μg/kg体重),每小时注射一次,共持续6 h(注射7次)。另外,在注射前3 h和打完第3针后,分别以黄芩苷或溶剂灌胃一次。在距离注射最后一针2 h后,使用颈椎脱臼法处死小鼠并取胰腺固定,进行石蜡切片和苏木精-伊红(H&E)染色。结果:(1)在小鼠巨噬细胞中,RIPK1抑制剂Nec-1或RIPK3抑制剂GSK′872都能明显抑制LPS和IDN-6556诱导的细胞坏死,说明LPS和IDN-6556诱导了坏死性凋亡。黄芩苷能够剂量依赖性地抑制巨噬细胞中LPS和IDN-6556联合诱导的坏死性凋亡。(2)Nec-1和GSK′872能够有效抑制TNF-α、LCL-161和IDN-6556(TSI)诱导的细胞坏死,表明TSI诱导了坏死性凋亡。黄芩苷能够以剂量依赖的方式抑制巨噬细胞中TSI诱导的坏死性凋亡。(3)LPS+IDN-6556或TSI处理能诱导巨噬细胞释放HMGB1,而黄芩苷能够剂量依赖性地抑制HMGB1释放至上清中,但RIPK3和MLKL的磷酸化水平并不受黄芩苷处理的影响,表明黄芩苷抑制细胞发生坏死性凋亡并非通过抑制RIPK3和MLKL磷酸化等上游信号而发挥效应。(4)虽然在还原条件下,黄芩苷对MLKL或p-MLKL蛋白水平没有明显的影响,但在非还原条件下,黄芩苷能够剂量依赖性地减少MLKL和p-MLKL的寡聚化,表明黄芩苷是通过抑制p-MLKL的寡聚化过程而抑制细胞发生坏死性凋亡。(5)ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够部分抑制BMDM中TSI诱导的坏死性凋亡和HMGB1释放,表明ROS的产生参与了巨噬细胞发生坏死性凋亡的过程。与黄芩苷相似,在还原条件下,NAC对RIPK3和MLKL的磷酸化水平没有明显影响,但在非还原条件下,NAC能剂量依赖性地抑制MLKL/p-MLKL的寡聚化,表明ROS参与了p-MLKL的寡聚化过程。另外,黄芩苷能明显降低胞内线粒体的超氧化物水平和保护线粒体膜电位,表明黄芩苷可能通过阻止线粒体产生ROS而抑制p-MLKL的寡聚化作用。(6)在雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型中,黄芩苷灌胃给药能明显降低腺泡细胞的坏死率和组织损伤的严重程度,表明黄芩苷能够明显减轻雨蛙素诱导的急性胰腺炎的症状。结论:黄芩苷可能通过减少线粒体ROS的产生而抑制p-MLKL的寡聚化作用,从而抑制巨噬细胞发生坏死性凋亡。在小鼠模型中,黄芩苷能减轻雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎的症状。因此,黄芩苷可能是治疗坏死性凋亡相关的炎症性疾病的潜在药物。