糖络宁通过SIRT1/P53通路减轻KK-Ay小鼠坐骨神经凋亡的机制研究

作     者：辛竞妍 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张涛静

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：糖络宁 糖尿病周围神经病变 SIRT1/P53 

摘      要：研究目的本研究从动物实验,针对SIRT1/P53通路来探讨糖络宁防治DPN的作用机理。通过坐骨神经组织病理形态学观察以及SIRT1/P53通路相关蛋白表达,验证SIRT1/P53通路在DPN发病中的作用。研究方法8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠10只,喂养普通饲料,设为正常组;35只SPF级雄性KK-Ay小鼠,喂养高脂饲料四周,检测小鼠的随机血糖水平达到16.7mmol/l,则认为糖尿病模型建立成功,持续给予高脂饮食,以保持血糖水平在较高的范围内。去除在造模过程中因各种原因死亡的5只小鼠,将其余造模成功的KK-Ay小鼠随机分为模型组(n=10)、糖高组(n=10)、糖低组(n=10),糖低组按糖络宁生药颗粒10 g/(kg·d)灌胃,糖高组按糖络宁生药颗粒20 g/(kg·d)灌胃,正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃,持续8周。每天观察小鼠的行为,检测小鼠0w和给药后2w、4w、6w、8w血糖、体重变化。在第8w取材,用LFB髓鞘染色、HE染色、TUNEL染色及透射电子显微镜观察小鼠坐骨神经病理形态改变,用Western Blot法检测坐骨神经组织中SIRT1、P53、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3 蛋白的表达。结果1.各组小鼠行为学观察结果:模型组小鼠毛色萎黄无光泽,精神萎靡,行动迟缓,多饮多食多尿,气味较重;糖高组和糖低量组也出现上述症状,但较模型组轻。2.各组小鼠体重对比结果:组间比较:与正常组相比,模型组、糖高组、糖低组同期体重明显增高(P0.05)。与模型组相比,糖高组、糖低组8周体重明显下降(P0.05)。3.各组小鼠血糖对比结果:模型组、糖高组、糖低组同期血糖较正常组明显增高(P0.05)。4.各组小鼠坐骨神经LFB髓鞘染色结果:模型组坐骨神经组织出现髓鞘断裂、脱髓鞘现象。治疗组小鼠坐骨神经组织局部可见髓鞘断裂,但较模型组明显改善。5.各组小鼠坐骨神经HE染色结果:模型组神经纤维分布稀疏,排列不均匀,杂乱无章,较分散,出现数量下降、结构不清晰、形态不规整等变化,部分神经可见肿胀,神经纤维之间的缝隙增大,部分神经纤维髓鞘肿胀、密度不均匀,出现脱髓鞘改变,轴索萎缩变细,同时雪旺细胞明显减少;与模型组相比,糖高组损伤的神经纤维部分恢复,髓鞘形态趋于规整,厚薄均匀,轴索位于神经纤维的中轴,病变程度较轻,与模型组相比,糖低组神经纤维部分恢复,可见髓鞘断裂,部分髓鞘呈空泡状。6.各组小鼠坐骨神经TUNEL染色结果:与正常组相比,模型组、糖高组与糖低组坐骨神经阳性细胞百分比有显著差异,且具有统计学意义(P0.05)。7.各组小鼠坐骨神经电镜观察结果:模型组小鼠髓鞘板层结构大面积松散,皱缩,可见斑块状脱髓鞘和节段性脱髓鞘,可见空泡变性,内部可见多个凋亡小体,神经微丝及血管分布较丰富;糖低组小鼠可见坐骨神经髓鞘变性,胞浆中空泡变性,但髓鞘板层排列整齐;糖高组小鼠坐骨神经髓鞘结构较为完整,髓鞘可见肿胀,形态趋于规则。*** Blot检测结果:与正常组相比,模型组SIRT1蛋白相对表达量降低(P0.0001),acetyl-p53、Cleaved Caspase-3 蛋白表达量及 Bax/Bcl-2 比值升高(P0.0001);与模型组相比,糖高组、糖低组SIRT1蛋白相对表达量升高(P0.0001),acetyl-p53、Cleaved Caspase-3 蛋白表达量及 Bax/Bcl-2 比值降低(P0.0001)。结论1.糖络宁可改善糖尿病小鼠的一般状态、血糖;2.糖络宁能通过激活SIRT1/P53通路,上调SIRT1蛋白表达,下调P53、Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表达,从而改善糖尿病小鼠坐骨神经组织的形态,减轻细胞凋亡,减缓DPN的发展。