HPV16编码的环状RNA circE7通过下调LGALS9促进口腔鳞癌免疫逃逸

作     者：郭佳玥 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾朝阳

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：口腔鳞癌 人乳头状瘤病毒 circE7 LGALS9 免疫逃逸 

摘      要：研究目的:口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤,占口腔颌面部恶性肿瘤90%以上。近年来口腔鳞癌的发病率持续上升,吸烟、饮酒、咀嚼槟榔和人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染等多种因素影响着口腔癌的发生发展。肿瘤免疫治疗通过激发或重建机体的免疫系统来控制和杀伤肿瘤细胞,是继手术、放疗、化疗和靶向治疗后一种有效的肿瘤治疗手段。然而目前免疫治疗的优势人群仍不清楚,现有针对PD-1/PD-L1免疫检查点为主的肿瘤免疫疗法在口腔鳞癌中的应用有限,亟待探索新的免疫治疗靶点和联合治疗方案。人乳头状瘤病毒被认为是口腔鳞癌的重要致病因素,涉及口腔鳞癌多种恶性表型,包括促进逃避免疫监视。但HPV16编码的环状RNA circ E7在口腔鳞癌中的生物学功能尚不完全清楚。本课题旨在探究HPV编码的环状RNA circ E7对口腔鳞癌免疫逃逸的影响及作用的分子机制,寻找临床检测分子标志物及潜在的治疗靶标。研究方法:我们首先利用跨拼接位点引物进行聚合酶链式反应检测HPV16编码circ E7在HPV16阳性口腔鳞癌细胞中的表达情况。RNase R和放线菌素D处理口腔鳞癌细胞,检测circ E7在口腔鳞癌细胞中的稳定性。荧光原位杂交和核质分离实验检测circ E7的细胞内定位。原位杂交和免疫组化检测circ E7在口腔癌组织中的表达情况以及CD8T细胞在组织中的浸润程度。通过HPV阴性的口腔鳞癌细胞中过表达circ E7或HPV阳性的口腔鳞癌细胞中敲低circ E7,RT-qPCR检测circ E7对口腔鳞癌细胞中免疫检查点分子的影响。通过T细胞体外共培养实验模型、流式细胞术、酶联免疫吸附试验和RT-qPCR检测CD8T细胞功能和凋亡,在体外评价circ E7和LAGLS9对CD8T细胞功能的影响。RNA pull down结合质谱分析和RIP-qPCR实验检测circ E7与乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl-Co A carboxylase alpha 1,ACC1)的结合。乙酰辅酶A检测试剂盒检测circ E7对细胞内乙酰辅酶A水平的影响。Ch IP-qPCR技术检测circ E7对半乳糖凝集素-9(galectin-9,LGALS9)启动子区域的乙酰化水平的影响。通过T细胞体外共培养实验模型、流式细胞术、酶联免疫吸附试验和RT-qPCR检测CD8T细胞功能和凋亡,在体外评价细胞程序性死亡受体1(Programmed cell death receptor 1,PD-1)和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3,TIM-3)单抗联合治疗的疗效。通过T细胞过继治疗裸鼠移植瘤模型、小动物活体成像、流式细胞术和酶联免疫吸附试验等技术检测T细胞活性和凋亡,在体内评价circ E7对于口腔鳞癌肿瘤免疫逃逸的作用和PD-1和TIM-3单抗联合治疗的疗效。研究结果:***16编码的环状RNA circ E7在口腔鳞癌中高表达通过跨拼接位点引物进行PCR及Sanger测序验证,发现HPV16编码的circ E7在HPV16阳性的口腔鳞癌细胞系及部分口腔鳞癌组织中表达。RNase R和放线菌素D处理HPV16阳性的口腔鳞癌细胞,发现circ E7在HPV16阳性的口腔鳞癌细胞系中表达稳定,表明circ E7以环状RNA形式存在。RNA FISH和核质分离实验表明circ E7主要定位于HPV16阳性口腔鳞癌细胞的胞质中,且在细胞质和细胞核中均存在表达。免疫组化及原位杂交发现circ E7口腔鳞癌组织中高表达,且与CD8T细胞的浸润程度呈负相关。2.口腔鳞癌中Circ E7抑制LGALS9的表达在HPV16阴性的口腔鳞癌细胞系过表达circ E7或在HPV16阳性的口腔鳞癌细胞系中敲低circ E7,发现过表达circ E7显著降低LGALS9的表达,而敲低circ E7能够显著回复LGALS9的表达。原位杂交和免疫组化发现,circ E7与LGALS9的表达在口腔鳞癌临床组织中呈显著负相关,且LGALS9的高表达与口腔鳞癌患者不良预后相关。3.口腔鳞癌细胞中LGALS9促进CD8T细胞的功能在口腔鳞癌细胞中过表达或敲低LGALS9,并与原代T细胞进行体外共培养,流式细胞术、ELISA和RT-qPCR检测发现口腔鳞癌细胞中过表达LGALS9能够上调CD8T分泌细胞因子的效应能力和减少CD8T细胞的凋亡,而敲低LGALS9抑制CD8T细胞分泌细胞因子的效应能力和促进CD8T细胞的凋亡。LGALS9和高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Box1,HMGB1)均为TIM-3的配体