CYP105A1羟化酶与电子传递呼吸链的共表达及其全细胞催化合成活性VD3的研究

作     者：杨柳贞 

作者单位：浙江工商大学 

学位级别：硕士

导师姓名：于平

授予年度：2021年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：辅酶NADPH 羟化酶CYP105A1 电子传递链Fdx-FdR 活性VD3 全细胞催化 

摘      要：维生素D(Vitamin D,VD)是一种脂溶性维生素,其本身无生理活性,需要通过CYP450酶在肝脏中进行25-羟基化,在肾脏中进行1α-羟基化,最终形成具有生理活性的25(OH)VD和1α,25(OH)VD。活性VD在维持血钙平衡、调节钙磷代谢、调节免疫、诱导细胞增殖与分化、预防骨质疏松等方面具有重要意义。化学合成法生产活性VD涉及一系列复杂的化学反应,步骤繁琐、成本高、污染严重,不适用于工业化大规模生产,随着人们对活性VD日益增长的需求,寻找合适的生产方式极为重要。目前应用广泛的是使用微生物转化法生产活性VD,该法具有高度立体选择性、反应条件温和、步骤少、特异性强、转化效率高、污染小等的优点,前景可观,可适合于工业化生产。辅酶NADPH在羟基化过程中作为电子供体,可以提高VD羟基化效率。但目前在微生物催化研究中,都是人为添加外源辅酶NAD(P)H,成本高昂且效率低。因此本研究利用基因工程技术,将合成辅酶NADPH的关键酶基因构建到大肠杆菌中,实现辅酶NADPH循环高效再生,降低成本,提高经济效益。在此基础上构建具有VD羟化酶CYP105A1、电子传递呼吸链Fdx-Fd R以及辅酶NADPH循环再生关键酶Glk-Zwf的一菌多酶体系的基因工程菌,实现VD高效率羟基化反应,为工业化生产活性VD奠定理论基础。主要研究内容如下:(1)本研究成功构建了含有NADPH再生的两个关键酶的重组工程菌*** BL21/p ETDuet-1-glk-zwf,葡萄糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶均得到了可溶性表达,实现了辅酶NADPH的高效再生。同时研究了IPTG、温度、接种量、装液量等对辅酶NADPH再生的影响,其中温度因素影响最为显著,并进行了正交设计优化实验,重组工程菌株在最佳工艺条件温度20℃、IPTG 0.25 m M、接种量1.5%,在1 L发酵摇瓶诱导培养48h后,辅酶NADPH最高产量达到了151.79μmol/L。(2)成功构建了一菌多酶体系的基因工程菌,即同时包含羟化酶CYP105A1、电子传递呼吸链Fdx-Fd R以及辅酶NADPH再生关键酶Glk-Zwf的重组菌株*** BL21/p ETDuet-1-cyp105a1-fdx-fdr-glk-zwf,并且五个目的蛋白均得到了可溶性表达。建立了VD羟基化体系,在无需添加外源辅酶NAD(P)H的条件下,构建成功的重组菌株即可实现全细胞催化底物VD合成具有生理活性VD的目的,证实了一菌多酶体系的重组菌株具有羟基化能力。(3)同时研究了催化温度、初始p H、生物催化剂负载量、底物浓度对VD羟基化效率的影响。研究表明在全细胞催化体系中的底物浓度对羟基化效率的影响最为显著,并且进行了正交优化设计实验,在最佳工艺条件下进行VD羟基化反应,得到了中间产物25(OH)VD产量为80.99 mg/L,产物得率与底物VD转化率分别为10.07%、4.93%,转化率比未优化前提高了2倍;继续催化120 h后得到最终产物1α,25(OH)VD产量为111.07 mg/L,产物得率与VD转化率分别为12.16%、7.20%,转化率比未优化前提高了近4倍。(4)利用同一批生物催化剂通过分批补料策略进行全细胞生物催化VD实验。实验结果表明,以0.5 g/L VD分批次补料,在连续催化72 h后,得到中间产物25(OH)VD与最终产物1α,25(OH)VD产量分别为395.92 mg/L、272.21 mg/L,从而证明了通过分批补料策略进行羟基化反应,可以提高活性VD的产量。与此同时,检测了羟基化体系中辅酶NADPH含量的变化,试验结果表明两种活性目的产物产量与辅酶NADPH含量变化具有一定的相关性。