氯消毒诱导的活而不可培养态细菌的低代谢活性机制

作     者：亓峥 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘春光

授予年度：2023年

学科分类：08[工学] 0815[工学-水利工程] 

主      题：氯消毒 活而不可培养态 铜绿假单胞菌 代谢组学 生物标志物 

摘      要：环境中的细菌98%以上为活而不可培养态(VBNC)细菌,即具有较低代谢活性但无法在标准培养基上进行分离培养的细菌。环境胁迫,如抗生素、低温、高压、饥饿、氧化胁迫等也会诱导细菌进入VBNC状态。环境胁迫诱导的VBNC态细菌在适宜条件下可以恢复在培养基上生长繁殖的能力,同时致病性也随之恢复。遗传分子生物学的研究表明VBNC态细菌具有代谢活性较低的特征,但由于基因型、表型、数量和功能之间的差异,目前对VBNC态细菌具体的代谢机制还知之甚少。这影响了 VBNC态细菌的精准识别及彻底去除,从而诱发严重的农产品病虫害和人类健康风险。因此,阐明VBNC态细菌低代谢活性的调节机制,可增强对VBNC态细菌生态功能的认识、健康风险评估以及实现对有害VBNC态细菌的有效管控。氯消毒作为一种常用的消毒技术,可以诱导细菌进入VBNC状态。铜绿假单胞菌是最常见条件病原微生物之一,且在进入VBNC状态后仍能产生毒力蛋白,从而对公众健康和饮用水安全构成重大威胁。因此,本研究以氯胁迫诱导的VBNC态铜绿假单胞菌为模型,研究了种群水平和单细胞水平上VBNC态细菌的代谢特征和标志物,并基于其代谢调节策略探究VBNC态细菌维持活性的关键通路。具体研究及结果如下:(1)从种群和单细胞水平研究了 VBNC态细菌的代谢特征。基于非靶向代谢组学的GC-MS/MS研究分析VBNC态细菌种群水平上的代谢谱和生物标志物,并分析其维持活性的代谢调节策略。通过同位素示踪(D、15N、13C)耦合拉曼光谱在单细胞水平上分析VBNC态细菌生物大分子的代谢差异,并获得单个VBNC态细菌的代谢指纹。研究结果表明,氯胁迫诱导的VBNC态细菌整体代谢活性呈下调趋势,生物大分子的合成代谢能力降低,但乙醛酸循环、脂肪酸和甘油磷脂代谢能力上调。此外,VBNC态细菌具有更显著的代谢异质性。(2)阐明了乙醛酸循环维持VBNC态细菌代谢稳态的机制。通过评估阻断乙醛酸循环后VBNC态细菌的呼吸活性、复苏能力以及生物膜生长能力,探究其在维持VBNC态细菌低代谢活性中的关键作用,并基于代谢组学研究乙醛酸循环维持VBNC态细菌胞内代谢稳态的具体机制。研究结果表明,乙醛酸循环是维持VBNC态细胞内代谢稳态的关键通路,而阻断乙醛酸循环会彻底灭活VBNC态细菌。涉及的主要机制是阻断乙醛酸循环导致VBNC态细菌碳水化合物和脂肪酸代谢的中断,从而使VBNC态细菌能量代谢系统紊乱;同时导致抗氧化物的丰度降低以及生物膜合成受阻,两者共同导致细菌的抗氧化系统崩溃。(3)探究了甘油磷脂-脂肪酸代谢轴调节VBNC态细菌形成适应性形态的机制。场扫描电子显微镜观察到细菌进入VBNC状态后会细胞体积缩小但细胞膜完整,基于代谢组学分析了 VBNC态细菌通过调节甘油磷脂-脂肪酸代谢轴形成适应性形态的具体机制。研究结果表明,VBNC态细菌通过调节甘油磷脂-脂肪酸代谢轴来缩小细胞尺寸,同时维持较低水平的能量代谢和抗氧化系统稳态来形成适应性形态。主要机制是VBNC细菌通过降解脂肪酸使细胞体积最小化,同时补充乙醛酸循环以维持细胞内能量代谢的必要水平。同时,甘油磷脂代谢补充了脂肪酸,维持了细胞膜的完整性,防止HClO进入细胞。此外,甘油磷脂-脂肪酸代谢轴的调节保持了细胞内抗氧化剂的丰度,防止VBNC细菌脂质过氧化。本研究有助于实现VBNC态细菌的精准识别和有效管控,为开发清洁高效的新型消毒方法提供了思路,从而降低VBNC态细菌带来的环境健康风险,对于维护公众健康和饮用水安全具有重要意义。