多巴胺D1受体激动剂通过调节巨噬细胞炎症反应和气道上皮细胞屏障功能减轻急性肺损伤

作     者：孟林林 

作者单位：山东中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘庆华

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：急性肺损伤 多巴胺受体 SKF38393 Nrf2 肺巨噬细胞 气道上皮屏障 

摘      要：目的探讨多巴胺D1样受体激动剂SKF38393(SKF)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)小鼠模型的巨噬细胞炎症反应、氧化应激及气道上皮细胞屏障功能的调节作用及潜在机制。方法体外培养THP-1细胞(诱导分化为巨噬细胞)和Beas-2B细胞,并用含或不含SKF/ML385的LPS刺激。通过实时定量PCR(q PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子(CCL2、IL-6、IL-1β)的表达;共聚焦显微镜及微孔板读数仪检测线粒体活性氧(m ROS)的水平;免疫印迹实验检测相关通路的活化情况;检测Beas-2B细胞单层跨膜电阻(TEER)以反应上皮屏障功能。选用6～8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为PBS对照组、SKF处理组、LPS造模组、LPS+SKF治疗组及LPS+SKF+ML385抑制剂组。随后收集小鼠肺泡灌洗液(BALF)及肺组织。采用ELISA测定BALF中IL-6、KC、G-CSF和TNF-α的表达水平;组织病理学、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)分析分别检测肺损伤的严重程度、肺内巨噬细胞及气道上皮细胞内D1样多巴胺受体(DRD1、DRD5)的分泌水平和气道上皮细胞中紧密连接蛋白(ZO-1、occludin)的表达情况;免疫印迹实验检测相关炎症通路的活化情况。结果通过使用THP-1细胞衍生的巨噬细胞和Beas-2B细胞,多巴胺D1样受体激动剂SKF有效抑制了LPS激发的促炎细胞因子的表达和线粒体ROS的产生,同时提高了LPS下调的气道上皮细胞(Airway epithelial cell,AEC)单层的TEER和连接蛋白(ZO-1、occludin)的表达。此外,SKF还对多种炎症信号通路具有广泛的抑制作用,包括NF-κB、MAPK和NLRP3/Caspase-1通路。体内实验表明,多巴胺D1样受体D1(DRD1)和D5(DRD5)主要分布在肺巨噬细胞和肺泡上皮细胞中。SKF预处理明显增加了DRD5、抗氧化因子NQO1的表达以及LPS减少的气道上皮细胞中紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达,减少了BALF总细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量。SKF可以抑制小鼠BALF中总蛋白的渗漏和细胞因子KC、IL-6、G-CSF的产生。此外,SKF可以抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1炎症通路的激活。SKF在体内、体外的保护作用可被Nrf2的抑制剂ML385部分抵消。结论在此,我们发现LPS诱导的ALI肺中巨噬细胞和气道上皮细胞中D1样受体的表达减少,并确定了SKF对这些细胞类型的保护作用,其潜在机制与Nrf2抗氧化系统的激活有关。此外,SKF在减轻ALI小鼠模型的肺部炎症损伤方面也发挥了显著的作用。