基于实时荧光定量PCR的高效转基因棉花拷贝数检测方法探究

作     者：姚静 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：涂礼莉;邓汉卿

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：棉花 SYBR Green实时荧光定量PCR 转基因拷贝数 Southern blot 

摘      要：棉花(Gossypium hirsutum)是重要的经济作物,到2019年末,全球范围内转基因棉花的种植面积是棉花总种植面积的76%。对于转基因植物,外源基因的拷贝数是影响其自身表达水平以及遗传稳定性的关键因素,需要高通量的外源基因拷贝数的检测方法应用于转基因育种。到目前为止,一般利用Southern blot进行外源基因插入拷贝数分析。但棉花次生代谢物质丰富,批量化DNA提取难以达到Southern blot的质量水平;另外棉花基因组大,很难保证DNA酶切、电泳、转膜等繁琐环节后,尼龙膜上还有相对大的DNA总量,因此杂交信号总是很弱,所以棉花的Southern blot在不同实验室很难重复,更无法批量化。本实验室虽然具备成熟的条件可以完成Southern blot,但该实验在研究生群体中的重复性不高,容易造成大量人力物力的浪费,实验进度严重滞后。因此,开发新的高效外源基因拷贝数检测技术非常必要。本研究旨在与生物技术公司合作,开发方便高效的检测试剂盒。本研究利用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,以棉花内源泛素酶基因GhUB7为内参基因,开发了一种基于相对定量法的外源基因拷贝数检测方法,以构建的包含内参基因UB7和外源基因Cas9、NPTⅡ、35S、Ubi的标准质粒作为参照,对转基因棉花的外源基因Cas9、NPTⅡ、35S、Ubi进行拷贝数检测。结果显示,内参基因UB7和外源基因Cas9、NPTⅡ、35S、Ubi扩增的标准曲线的相关系数(R)都接近于1,并且扩增效率都相近同时接近于100%,其中内参基因UB7的扩增效率为101%;外源基因Cas9、NPTⅡ、35S、Ubi的扩增效率分别为99%,98%,102%,102%。经过Southern blot验证,本研究构建的检测外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法的结果与Southern blot的检测结果的相关系数为0.8962。本研究建立了快速、高效的转基因棉花外源基因Cas9、NPTⅡ、35S、Ubi的拷贝数分析体系,从而简化了转基因棉花拷贝数鉴定的流程并提高了检测通量,目前已经申请专利,正在生产试剂盒试用装,该技术也能在其他作物中推广应用。