FTO促进幽门螺杆菌感染胃上皮细胞恶性转化的作用及机制

作     者：成莎 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐灿霞

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：幽门螺杆菌 Cag A m6A FTO CD44 恶性转化 

摘      要：背景和目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)持续性刺激诱导的人正常胃黏膜上皮恶性转化是胃癌发生发展的重要始动环节。然而,H.pylori在胃黏膜炎症反应至肿瘤发生这一持续发展过程中的发病机制尚不明确。6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰是真核生物细胞中最常见、最丰富、具有动态可逆特性的RNA修饰,在调节前体m RNA成熟、翻译和降解中起着关键作用。脂肪和肥胖相关蛋白(The fat mass and obesity-associated protein,FTO),是已知的去甲基化酶之一,参与了胃癌的发生发展。但FTO在H.pylori慢性感染导致胃黏膜上皮恶性转化过程中的具体机制尚不明确。本研究旨在探索细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A,Cag A)阳性H.pylori(Cag AH.pylori)慢性感染后FTO介导的m6A修饰对人胃上皮细胞(GES-1)的作用及机制,为胃黏膜上皮恶性转化的发病机制和胃癌防治提供新的思路和靶点。方法:(1)分别用Cag A和Cag AH.pylori与GES-1细胞共培养,构建H.pylori急性和慢性感染细胞模型,通过CCK-8、Western Blot、流式分析、细胞集落形成实验、Ed U实验、活/死细胞双重染色实验、Transwell实验和划痕实验,观察GES-1细胞活力、凋亡、增殖和迁移能力;(2)采用Western Blot和q RT-PCR检测对照组、Cag A和Cag AH.pylori慢性感染的GES-1细胞中FTO和胃癌干细胞分子标记物CD44的表达水平;通过慢病毒和质粒转染构建FTO敲低和过表达的GES-1细胞株进一步验证;结合生物信息学分析预测CD44RNA m6A修饰位点,通过甲基化RNA免疫共沉淀实验(Me-RIP)及q RT-PCR检测H.pylori慢性感染组和FTO沉默后CD44 RNA m6A水平;(3)使用BALB/cnude裸鼠进行皮下成瘤实验,通过观察肿瘤体积和裸鼠重量比较不同H.pylori慢性感染的GES-1细胞在裸鼠体内的成瘤能力;(4)生物信息学分析FTO在胃癌中的表达和预后价值;收集胃癌组织和癌旁组织验证FTO和CD44的表达。结果:(1)Cag AH.pylori急性感染时,随着H.pylori感染浓度的升高,GES-1细胞凋亡增加,活力下降,但在Cag AH.pylori慢性感染时GES-1细胞出现恶性转化,表现为细胞蜂鸟表型、凋亡减少、增殖、迁移能力增强,CD44表达增加;(2)Cag AH.pylori慢性感染后GES-1细胞FTO表达增高,抑制FTO表达可以逆转GES-1细胞的恶性转化;Western Blot和q RT-PCR结果提示CD44的表达水平与FTO的表达呈正相关;当FTO表达升高时,CD44 RNA的m6A修饰减少,而沉默FTO后,CD44 RNA的m6A修饰增加;(3)对照组和Cag AH.pylori慢性感染组的GES-1细胞不易成瘤,而Cag AH.pylori感染组的GES-1细胞成瘤性高,瘤体积大,当沉默FTO后GES-1成瘤能力明显下降。(4)FTO和CD44在胃癌组织中高表达,FTO与胃癌不良预后相关。结论:(1)Cag AH.pylori慢性感染上调FTO的表达参与胃黏膜上皮恶性转化;(2)FTO可以调控CD44 m6A修饰水平。图14幅,表14个,参考文献73篇