吉祥安坤丸治疗卵巢早衰小鼠的实验研究

作     者：安荣荣 

作者单位：内蒙古医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何金英

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：卵巢早衰 环磷酰胺 吉祥安坤丸 信号通路 

摘      要：目的探讨吉祥安坤丸对于化疗药物环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)诱导的卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)模型小鼠的卵巢功能修复作用及作用机制,为临床使用吉祥安坤丸治疗卵巢早衰提供理论基础。方法筛选动情周期正常的健康雌性小鼠50只,随机挑选10只为空白对照组,每天以8㎎/㎏蒸馏水腹腔注射30天,剩余40只根据文献报道及预实验结果以CTX 8㎎/㎏的剂量连续腹腔注射30天进行POF模型构建。期间进行阴道脱落细胞涂片检查动情周期,观察小鼠一般情况并记录体重变化。40只CTX造模小鼠随机分为4组:模型组10只、低剂量药物治疗组10只、中剂量药物治疗组10只、高剂量药物治疗组10只。造模结束后24h进行给药:空白对照组和模型组给予生理盐水连续灌胃14天,低剂量给药组给予低浓度吉祥安坤丸药液(0.026g/ml)连续灌胃14天,中剂量给药组给予中浓度吉祥安坤丸药液连续灌胃14天(0.052g/ml),高剂量给药组给予高浓度吉祥安坤丸药液(0.078g/ml)连续灌胃14天。给药结束次日采血,ELISA法测血清雌二醇(Estradiol,E)、抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone,AMH)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)水平;采血后处死小鼠,取双侧卵巢,一侧卵巢组织HE染色,光学显微镜下观察卵巢组织形态变化并计数原始卵泡、初级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡数目;另一侧卵巢Western Blot法检测卵巢组织中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、苏氨酸激酶(AKT)、雷帕霉素靶蛋白(m TOR)水平变化,相关数据进行统计学分析。结果1.空白对照组动情周期正常,造模组在腹腔注射环磷酰胺30天后动情周期紊乱,成功构建了POF小鼠模型。2.血清性激素水平:模型组小鼠与对照组小鼠比较,血清中E2、AMH水平降低(3.11±0.35vs5.60±0.90,P0.05;172.98±27.72vs263.56±19.54,P0.05),FSH水平升高(36.78±2.99vs 25.22±4.71,P0.05),差异均具有统计学意义;低剂量治疗组E2值分别为160.39±12.44,FSH值为32.62±2.61,AMH值为3.46±0.38,与模型组比较E2及FSH水平下降,AMH水平升高,但无统计学意义;中剂量治疗组、高剂量治疗组E2值分别为191.89±19.42、200.85±28.01,与模型组比较均有升高,差异具有统计学差异(P0.05);FSH值分别为29.99±4.95、26.53±2.37,与模型组比较均有降低,且差异具有统计学意义(P0.05);AMH值分别为4.34±0.38、4.22±0.36与模型组比较均升高,且差异具有统计学意义(P0.05)。3.卵泡计数:模型组与对照组相比,原始卵泡数减少(76.20±7.40vs103.40±7.44)、初级卵泡数减少(57.20±6.02vs75.40±4.93)、成熟卵泡数减少(56.40±4.16vs70.40±5.68)、闭锁卵泡数增多(43.80±3.27vs31.00±3.39),且差异均有统计学意义(P0.05)。低剂量治疗组原始卵泡数(75.40±5.86)、初级卵泡数(61.00±9.57);成熟卵泡数(59.20±2.86)较模型组上升,但差异无统计学意义,闭锁卵泡数(40.40±3.51)较模型组下降,差异无统计学意义;中、高剂量治疗组原始卵泡数(83.00±4.18、90.60±4.04)、初级卵泡数(64.00±3.54、69.20±6.94)、成熟卵泡数(62.60±3.21、65.80±3.70)较模型组均增加,闭锁卵泡数(37.60±3.85、34.20±5.17)较模型组减少,且差异都具有统计学意义(P0.05)。4.Western Blot蛋白杂交结果:模型组与对照组相比,PI3K(0.63±0.02vs0.96±0.04)、Akt(0.63±0.03vs0.91±0.02)、m TOR(0.61±0.02vs0.92±0.02)的蛋白表达水平均下降,差异具有统计学意义(P0.05);低、中、高剂量吉祥安坤丸治疗组PI3K(0.72±0.02、0.79±0.01、0.88±0.02)、Akt(0.73±0.02、0.79±0.02、0.84±0.02)、m TOR(0.68±0.02、0.74±0.02、0.79±0.02)的蛋白表达水平较模型组均有所上升,差异具有统计学意义(P0.05)。结论1.成功构建了化疗损伤性卵巢早衰小鼠模型。2.吉祥安坤丸能有效修复POF小鼠卵巢功能。3.吉祥安坤丸可能通过上调自噬相关信号通路PI3K/Akt/m TOR中关键蛋白PI3K、Akt、m TOR的表达修复小鼠卵巢功能。