酵母和脂多糖诱导的小鼠不同体温变化的调控机制探究
作者单位：山东大学
学位级别：硕士
导师姓名：何钊
授予年度：2023年
摘 要：研究背景:肥胖已成为全球范围内重要的公共健康问题,是非传染性疾病的主要风险因素之一,因此,探究肥胖的成因及干预措施成为迫在眉睫的任务。热量摄取过量或消耗不足所造成的能量不平衡,是造成肥胖的根本原因。既往的减肥重点是增加运动和减少摄食,但由于依从性差和再复发风险高,使得实际结局并不理想。目前,药理学干预肥胖已成为新的重要方向,通过药物或其他方法抑制脂肪吸收或增加能量消耗以达到减肥目的。而通过提高机体基础代谢和适应性产热是最有效和最关键的增加能量消耗的途径之一,其中升高体温和降低环境温度以增加基础代谢和适应性产热导致的能量消耗是有效减肥方法之一。有研究表明,核心温度每升高1℃,基础代谢率增加10%-13%;环境温度每降低1℃,机体需要消耗46.3 kcal/m2/d。因此,体温调控机制的探究对于寻找干预肥胖的新思路和新途径显得尤为重要。感染引起的发热反应是机体在应对外界环境刺激时大脑调控体温升高的结果,在这个过程中,各系统活动增加,基础代谢消耗和适应性产热均显著增加。下丘脑视前区(the Preoptic area,POA)是体温调节中心,主导因环境温度改变和感染引起的体温调控,其中内侧视前区(the medial Preoptic area,MPA)、外侧视前区(the lateral Preoptic area,LPO)、腹内侧视前区(the ventral medial Preoptic area,VMPO)、中位视前核(the median Preoptic nucleus,MnPO)、内视前区(the medial Preoptic area,MPO)和腹侧视前区(the ventrolateral Preoptic area,VLPO)参与其中。目前认为不同病原体引起的发热在外周和中枢的机制是相似的,但临床上发现细菌感染可导致短暂的高热或低体温,真菌感染则引起持久反复的低水平发热,未发现低体温现象。临床观察和实验研究均表明细菌引起的发热向低体温这一转变与低环境温度相关,并且是预后差的征兆。然而为什么真菌性发热容易持久反复,真菌感染是否也会依赖环境温度引起低体温,细菌和真菌引起体温表现差异的机制是什么,均不清楚。这些体温差异调控机制的解析有助于理解体温调控的过程,为干预肥胖提供新的靶点和思路。研究方法:1.实验动物:C57BL/6N雄性小鼠(八周),12 h:12 h的暗-光环境、自由饮食、22℃和50%湿度条件下适应一周,所有注射统一在早晨9:00。2.动物模型:50μg/kg革兰氏阴性细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)溶液经尾静脉注射以诱导细菌感染性体温变化;20%安琪酵母混悬液以10 mL/kg剂量经颈背部皮下注射以诱导真菌感染性体温变化,分为实验前禁食12 h和全程自由饮食两组。对照组用相同方式注射同体积的生理盐水。实验动物分为LPS组、酵母组、盐水组。3.测温方法:直肠测温仪、腹腔微芯片遥测、红外成像仪分别监测小鼠直肠温度、腹腔核心温度、背部皮肤和尾部温度及肩胛区产热情况。4.免疫印迹技术:检测小鼠肩胛区棕色脂肪组织解耦连蛋白(Uncoupling protein-l,UCP-1)和酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)的表达水平,以评估棕色脂肪组织的产热情况。5.发热率的计算:汇总所有LPS和酵母诱导体温变化的结果,比较三种不同的测温方法对LPS和酵母致热性的影响。6.分别在30℃、26℃和22℃环境温度下,比较LPS和酵母诱导小鼠的体温变化。7.免疫组织化学染色:体温升至最高或最低点时,完整剥离小鼠脑组织,采集4个30μm厚的冠状脑切片(Bregma 0.38 mm-0.02 mm),监测下丘脑POA区c-Fos的表达情况,并用Adobe photoshop和Image Fiji等软件将脑图谱合并到全脑染色图,划分大脑区域,计数下丘脑POA区及其各核团的c-Fos+细胞数量。8.统计学处理:使用IBM SPSS 22.0软件统计、分析实验数据。采用双尾非配对学生t检验对不同组进行比较。*P0.05,**P0.01表示有统计学差异,所有结果均以平均数±标准误(Mean±SEM)表示。结果:1.LPS诱导小鼠体温变化实验发现:较低浓度LPS和较高环境温度更容易诱导小鼠发热;50 μg/kg的LPS可引起小鼠直肠温度、腹腔核心温度、背部红外温度均升高,最高升温值分别为1℃、3℃、2℃;体温峰值均出现在注射后4h。2.酵母诱导小鼠体温变化结果发现:真菌性发热不受饮食状态影响,酵母诱导禁食组和自由饮食组小鼠直肠温度和背部红外温度升高2℃、腹腔核心温度升高3℃;禁食组直肠或背部红外温度未检测到峰值,核心温度峰值出现在注射后5 h;自由饮食组直肠温度、核心温度、背部红外温度峰值分别出现在注射后7 h、5 h、6 h。3.免疫印迹、肩胛区温度结果发现:LPS和酵母诱导的体温升高伴随肩胛区棕色脂肪产热增多、尾部散热减少,LPS引起UCP-1和TH蛋白表达增多,而酵母没有。4.所有实验结果的发热率证明:酵母诱导的升温作用更稳定、更耐受实验操作刺激。5.三种不同环境温度下实验结果发现:LPS在30℃环境温度下引起小鼠发热,而在26℃或22℃条件下导致低体温;酵母则不受环境温度变化的影响,始终引起持久发热。6.免疫组织化学染色结果提示,与盐水组相比:30℃环境温度时,LPS和酵母均激活更多下丘脑POA神经元;22℃时,仅酵母可激活更多POA神经元;三种发热情况下VMPO均被明显激活;LPS引起小鼠低体温时MPO明显激活。结论:1.酵母比LPS具有更强、更稳定的升体温作用,且不受实验操作刺激、饮食状态和环境温度变化的影响,这与临床上真菌感染常表现为持久反复的发热是相符的。2.酵母与LPS的致升温作用以增加肩胛区棕色脂肪产热、减少尾部散热为基础。3.低环境温度下LPS导致低体温而非升温,是由于下丘脑POA神经元的激活缺失,主要是VMPO神经元的激活失败、MPO神经元的超常激活。4.红外测温是比直肠测温更直接方便、比腹腔遥测更便捷的方法。
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