ASH2L蛋白转运入核的分子机制研究

作     者：胡韦静 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨振华

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：ASH2L NLS 膜转运蛋白 核输入 

摘      要：组蛋白3赖氨酸4(Histone 3 Lysine 4,H3K4)甲基化在许多细胞过程中发挥重要作用,如DNA复制和转录、基因修复和重组。H3K4甲基化受损与各种人类疾病的发生相关,包括发育缺陷和癌症。SET1/MLL复合物能够促进H3K4的甲基化,并在造血、脂肪生成和发育的转录调节中发挥关键而独特的作用。ASH2L是所有已知的SET1/MLL复合物发挥作用的核心亚基之一,对于维持染色质的开放状态,保持胚胎干细胞增殖和分化的多能性至关重要。在广泛的人类癌症中,尤其是在白血病中,ASH2L蛋白质都存在着过度表达,而敲除ASH2L则能够抑制癌细胞的增殖。在本研究中,首先构建ASH2L的过表达质粒,并通过CO-IP拉出与ASH2L结合的所有蛋白,再利用质谱分析筛选出一系列与ASH2L存在结合的目标蛋白,质谱结果显示ASH2L与膜转运蛋白家族KPNA的多个成员存在关联,包括KPNA1、KPNA2、KPNA3和KPNA6。接着通过构建所筛选蛋白的过表达质粒,并用CO-IP验证其结合,发现KPNA1与ASH2L的结合现象显著,所以本研究主要探索ASH2L蛋白的核转运机制及其对癌症细胞的影响。为了研究ASH2L的核输入机制,首先通过预测ASH2L蛋白的核定位序列(Nuclear localization sequence,NLS),构建ASH2L蛋白的NLS缺失质粒,CO-IP实验和免疫荧光实验证明,ASH2L的NLS序列缺失导致ASH2L与KPNA1的结合消失,并且ASH2L转运入核被限制,ASH2L被阻滞在细胞质中。下一步为了研究ASH2L与KPNA1之间结合的具体位点,根据KPNA1的结构构建了多个KPNA1截断质粒,通过CO-IP实验发现ASH2L与KPNA1氨基酸75-403存在结合作用。接着构建了一系列带有GST标签的KPNA1截断质粒,并通过GST-Pull Down实验验证了ASH2L与KPNA1的结合为直接结合。接下来,通过构建一系列KPNA1缺失质粒,并通过CO-IP实验发现KPNA1氨基酸118-245区域是其与ASH2L结合的关键区域。接下来,将采取合成多肽的方法,阻断ASH2L核输入的途径,并检测多种白血病细胞系尤其是存在MLL1基因易位的白血病细胞系,在ASH2L蛋白核输入受阻的情况下发生的变化。本研究中,KPNA1是新发现的与ASH2L存在结合的蛋白,目前尚没有关于ASH2L核输入机制的研究,因此研究ASH2L蛋白的核输入机制以及ASH2L转运异常对于白血病细胞的影响具有重要意义,可以为研发新的治疗白血病的药物提供重要的理论支持。