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黄葵胶囊治疗慢性肾炎药效及作用机制研究

黄葵胶囊治疗慢性肾炎药效及作用机制研究

作     者:邹佳 

作者单位:昆明医科大学 

学位级别:硕士

导师姓名:李璠

授予年度:2023年

学科分类:1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题:黄葵胶囊 慢性肾炎 蛋白组学 网络药理学 作用机制 

摘      要:【目的】采用蛋白组学(Proteomics)与网络药理学(Network pharmacology,NP)相结合的研究方法,探讨黄葵胶囊治疗慢性肾小球肾炎(Chronic glomerulonephritis,CGN)的作用机制,为临床合理用药提供参考,为黄葵胶囊的临床推广应用提供更加充分的依据。【方法】(1)采用阳离子化牛血清白蛋白(Cationic bovine serum albumin,C-BSA)对40只SPF级SD大鼠进行诱导建立CGN大鼠模型。实验分为6组:正常组(NOR,n=8)、模型组(MOD,n=8)、氯沙坦钾组(LST,n=8)、黄葵胶囊低剂量组(HK-L,n=8)、黄葵胶囊中剂量组(HK-M,n=8)和黄葵胶囊高剂量组(HK-H,n=8)。给药4周后,检测大鼠24h尿蛋白含量、尿蛋白肌酐比(protein-to-creatinine ratio,PCR)、血肌酐(Serum creatinne,Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血清肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,通过苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察肾脏组织病理变化,免疫荧光观察大鼠肾脏Ig G沉积情况。(2)对NOR、MOD和HK-M组(后续实验中以HK组表示)大鼠肾组织进行蛋白组学检测分析,筛选得到差异蛋白。对差异蛋白进行基因本体(Gene ontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interactions,PPI)网络分析,挖掘黄葵胶囊治疗CGN的作用靶点。(3)基于网络药理学技术,通过文献查阅收集黄葵胶囊有关化学成分,使用Pub Chem数据库获得各组分的2D-SDF结构,并导入Swiss Target Prediction数据库,以“人类为研究物种检索得到黄葵胶囊的作用靶点。以“Chronic nephritic和“Chronic glomerulonephritis为关键词,从Gene Cards数据库中检索CGN相关基因。将黄葵胶囊作用靶点与CGN相关靶点进行映射并绘制Venny图,两者的交集部分即是黄葵胶囊治疗CGN的潜在作用靶点。使用Cytoscape 3.8.0软件构建黄葵胶囊成分-靶点-CGN网络。通过Metascape及STRING数据库对潜在的作用靶点进行GO与KEGG富集分析及PPI网络分析。(4)蛋白组学和网络药理学联合分析,探讨黄葵胶囊治疗CGN的作用靶点,通过相关理化实验对关键靶点和通路进行相关实验验证。【结果】(1)黄葵胶囊药效作用研究发现,与NOR相比,MOD组大鼠24 h尿蛋白含量、PCR、BUN、Scr、血清TNF-α、IL-6水平和MDA含量显著升高(P0.05),SOD活性明显降低(P0.05);经黄葵胶囊干预后,与MOD相比,黄葵胶囊各组24 h尿蛋白含量、PCR、BUN、Scr、血清TNF-α、IL-6水平和MDA含量显著降低(P0.05),SOD活性明显升高(P0.05)。通过病理检测发现,MOD组大鼠肾小球体积有明显增大的迹象,并且基底膜的厚度也出现了不同程度的增加,肾组织明显可见Ig G荧光沿肾小球系膜或基底膜弥漫性沉积,经黄葵胶囊治疗后,大鼠肾小球体积增大及基底膜增厚程度有明显的减轻,Ig G沉积现象得到明显改善。(2)蛋白组学结果显示,在肾脏组织中共定量出8055种蛋白,从NOR和MOD组肾组织中发现了2079个差异蛋白(1238个上调蛋白和841个下调蛋白),从MOD和HK组发现了1374个差异蛋白(502个上调蛋白和872个下调蛋白),在NOR、MOD和HK三个组间共有差异蛋白962个(576个上调蛋白和386个下调蛋白)。通过生物信息学分析发现,三组间差异蛋白的细胞定位主要在线粒体,涉及前体代谢产物和能量的产生、有机酸分解代谢、细胞呼吸等生物过程;主要的分子功能涉及氧化还原酶活性、细胞粘附分子结合、电子转移活性等。经KEGG通路富集分析发现,三组间差异蛋白被富集到肌动蛋白细胞骨架的调节、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3kinase-protein kinase B,PI3K-Akt)、和过氧化物酶体增殖物活化受体(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)等信号通路上。蛋白互作发现β-肌动蛋白(Actin cytoplasmic 1,ACTB)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Protein-serine-threonine kinase,AKT1)、ATP合成酶亚单位α(ATP synthase subunit alpha,ATP5A1)、纤维连接蛋白1(Fibronectin 1,FN1)、琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDHA)、顺乌头酸酶2(Aconitase 2,ACO2)、ATP合酶β亚基(ATP synthase subunit beta,ATP5B)、苹果酸脱氢酶2(Malate dehydrogenase 2,MDH2)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和细胞色素c(Cytochrome c,CYCS)等蛋白是重要的靶点蛋白。(3)网络药理学研究发现,黄葵胶囊50个主要成分对应靶点462个,CGN相关靶点1835个,取交集后获得黄葵胶囊治疗CGN的潜在作用靶点147个。GO富集分析得到1053个生物过程(biological processes,BP),55个细胞组分(cellular components,CC),88个分子功能(molecular functions,MF)。KEGG富集分析得到149条相关通路,主要富集在PI3K-AKT、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)、Ras相关蛋白1(Ras-related protein 1,Rap1)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)和核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)等信号通路途径。蛋白互作发现TNF、白蛋白(Albumin,ALB)、AKT1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3,CASP3)、信号和转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)、基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)、类固醇受体辅助激活因子(Steroid receptorcoactivator,SRC)、前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2)和Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)等蛋白是较为关键的蛋白。(4)蛋白组学和网络药理学联合分析发现,网络药理学和蛋白组学共有靶点13个,包括磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1(Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit1,PIK3R1)、AKT1、STAT3、F2、多聚ADP核糖转移酶(Poly ADP ribose polymerase,PARP1)、细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM1)、二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase 4,DPP4)、血浆激肽释放酶B1(Plasma Kallikrein B1,KLKB1)、凝血因子X(Coagulation factor X,F10)、非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶6(Non-receptor protein tyrosine phosphatase 6,PTPN6)、脂肪酸结合蛋白-3(Fatty Acid Binding Protein 3,FABP3)、葡萄糖-6-磷酸交换剂(Glucose-6-phosphate exchanger SLC37A4,SLC37A4)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase 1,CASP1)。共同富集的通路72条,包含缺氧诱导因子1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、PI3K-Akt、雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin kinase,m TOR)、Rap1、PPAR、FcγR介导的吞噬作用、肌动蛋白细胞骨架的调节等与肾病相关的信号通路。其中,STAT3、PIK3R1、AKT1为蛋白组学与网络药理学的共有靶点并参与调控多条与肾病相关的信号通路,可作为黄葵胶囊治疗CGN的核心靶点,在黄葵胶囊治疗CGN过程中发挥重要作用。经靶点验证发现,相比NOR,MOD组大鼠肾组织中STAT3、PIK3R1、AKT1蛋白表达量增多(P0.05);较MOD,HK组大鼠肾组织中STAT3、PIK3R1、AKT1蛋白表达量减少(P0.05),此结果与前期蛋白组学的实验结果一致。此外,对STAT3、PIK3R1、AKT1均涉及的HIF-1/VEGF信号通路中相关因子水平进行验证,结果显示,较NOR,MOD组大鼠肾组织中HIF-1α、VEGF蛋白表达量增多(P0.05);较MOD,HK组大鼠肾组织中HIF-1α、VEGF蛋白表达量减少(P0.05)。提示黄葵胶囊可以通过STAT3、PIK3R1和AKT1蛋白调控HIF-1/VEGF信号通路达到治疗CGN的目的。【结论】(1)黄葵胶囊可以显著改善CGN大鼠肾功能指标,减轻炎症和氧化反应,改善病理损伤,保护大鼠肾脏组织。(2)网络药理学和蛋白组学联合分析及实验验证发现,PIK3R1、AKT1、STAT3、F2、PARP1、ICAM1、DPP4、KLKB1、F10、PTPN6、FABP3、SLC37A4和CASP1等蛋白是黄葵胶囊治疗CGN的作用靶点,通过调控HIF-1、VEGF、PI3K-Akt、MAPK、NF-κB、Rap1、PPAR等信号通路发挥治疗CGN的作用。

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