机械性窒息与心源性猝死小鼠脑干差异性代谢物对比研究
作者单位：河北医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：丛斌
授予年度：2023年
主 题：机械性窒息 心源性猝死 脑缺氧 液相色谱质谱 代谢组学
摘 要：目的:机械性窒息及心源性猝死的死因鉴定是法医学实践中亟待解决的疑难问题,本研究通过成功建立小鼠机械性窒息死亡模型和心源性猝死模型,运用病理学技术观察了窒息过程中神经元及相关蛋白的表达变化,进一步采用液相色谱-质谱代谢组学技术,分析脑干样本代谢谱,筛选出鉴别窒息和心源性猝死的差异性代谢物,旨在为两种不同死亡原因的鉴别诊断提供科学依据。方法:组织学:将24只小鼠随机分为对照组(Control group,CON)6只,机械性窒息组(Mechanical asphyxia death group,MAD)6只,心源性猝死长时间组(Sudden cardiac death-long group,SCDL)6只,心源性猝死短时间组(Sudden cardiac death-short group,SCDS)6只;电镜:取CON组和MAD组各3只进行观察。代谢组:将24只小鼠随机分为CON组6只,MAD组6只,SCDL组6只,SCDS组6只。所有小鼠均给予异氟烷麻醉。CON组小鼠在麻醉下脱颈死亡,MAD组小鼠给予异氟烷麻醉,小鼠呼吸、心率平稳后,采用直径为0.51 cm的不规则尼龙绳间断性扼压颈部致小鼠10 min左右死亡,SCDL组小鼠腹腔注射1 g/kg异丙肾上腺素后10 min左右死亡,SCDS组腹腔注射1.5 g/kg异丙肾上腺素后1min左右死亡。取脑组织制作蜡块,HE、电镜、甲苯胺蓝染色和免疫组织化学染色观察基本病理形态改变,运用液相色谱-质谱联用法(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术观察脑干代谢谱的变化。结果处理及统计学分析:数据整理采用Excel 2016完成,用SPSS 23.0进行统计分析。免疫组化染色阳性强度值符合正态性检验和方差齐性检验的数据采用均数±标准差(Mean±SD)表示,组间数据的比较行单因素方差分析,用最小显著差法(Least significant difference,LSD)作两两比较;对脑组织两组间免疫组化染色阳性强度值采用两独立样本t检验进行比较。以上统计结果均以P0.05为有显著统计学差异。采用多元统计分析方法对数据进行模式识别分析,比对各组间代谢谱差异。基于KEGG数据库,运用变量重要性投影值和T检验,筛选机械性窒息下表达差异的代谢物并进行代谢通路富集分析,研究机械性窒息中代谢紊乱的影响及具体代谢途径。结果:1.HE染色结果:CON组脑干、下丘脑织结构清晰,细胞无明显病理学改变。MAD、SCDL和SCDS组,均出现数量不等的红色神经元,其中MAD组神经元缺血缺氧的病理学改变最为明显(图1和2)。2.电镜结果:CON组脑干神经元结构正常,无明显病理改变,线粒体嵴清晰可见,双侧膜结构界限清晰,内质网和高尔基体结构无异常,MAD组神经元发生明显固缩,线粒体嵴模糊不清,双层膜结构边界不清,内质网肿胀扩张,膜旁核糖体脱落,高尔基体肿胀扩张(图3)。3.甲苯胺蓝染色:CON组脑干、下丘脑神经元胞浆丰富,胞浆内尼氏体清楚可见。且SCDS组内尼氏体染色变浅,部分神经细胞水肿;SCDL组可见部分胞浆内尼氏体消失,神经细胞固缩改变;MAD组见尼氏体消失,固缩、深染的神经细胞数目增多(图4和图5)。4.免疫组织化学染色结果:4.1脑干免疫组化染色结果:4.1.1 HIF-1α在神经元表达情况CON组神经元胞浆中可见少量HIF-1α表达。与CON组相比MAD组表达显著升高。MAD组与SCDS组相比,HIF-1α表达显著升高,与SCDL组相比,HIF-1α表达升高(图6)。4.1.2 GFAP在星形胶质细胞表达情况GFAP在四组的星型胶质细胞中均有表达但无统计学差异(图7)。4.1.3 C-fos在神经元表达情况CON组神经元核内见C-fos少量表达,与CON组相比MAD组表达显著升高,SCDS组与MAD组相比表达降低,SCDS组比CON组表达升高,SCDS组和CON组表达无统计学差异(图8)。4.2下丘脑免疫组化染色结果:4.2.1 HIF-1α在神经元表达情况CON组神经元胞浆中可见少量HIF-1α表达,与CON组相比MAD组的表达明显升高,MAD组与SCDS和SCDL组相比,HIF-1α表达升高(图9)。4.2.2 GFAP在星形胶质细胞表达情况GFAP在四组的星型胶质细胞中均有表达但无统计学差异(图10)。4.2.3 C-fos在神经元表达情况CON组下丘脑神经元细胞核见C-fos少量阳性,MAD组与CON组相比表达显著升高,SCDS组与MAD组相比表达降低,SCDL组比CON组表达升高,SCDS组和CON组表达无统计学差异(图11)。5.代谢组学结果:基于LC-MS代谢组学平台,根据主成分分析(Principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析(Orthogonal partial least squares analysis,OPLS-DA)等模式识别分析方法进行代谢物轮廓分析,结果表明代谢物提取、数据采集和数据分析过程稳定,干扰因素少,质量控制良好,具有代表性,可进一步作出代谢组学分析。CON组与MAD组比较筛选出408种差异性代谢物,MAD组与SCDS组比较筛选出527种差异性代谢物,MAD组与SCDL组比较筛选出494种差异性代谢物。KEGG通路富集分析发现窒息与嘌呤代谢、胆碱代谢和能量代谢密切相关,MAD组分别与CON组、SCDS组和SCDL组比较后筛选出相关代谢物14种、14种和9种。结论:本研究通过CON组、MAD组、SCDS组和SCDL组四组病理学观察和代谢组学研究得出以下结论:1.MAD组与SCDS组、SCDL组的对比观察发现,常规病理学、超微结构、特染、免疫组化均表现为神经元缺氧性改变,其中MAD组神经元缺氧性损伤改变最为明显。2.CON组与MAD组脑干代谢组学分析表明窒息与嘌呤代谢,胆碱代谢,能量代谢通路密切相关,筛选出了14种与之相关的差异代谢物。MAD组与SCDS和SCDL组比较后分别筛选出的14种和9种差异代谢物,这些差异代谢物有望成为鉴别机械性窒息与心源性猝死的特异性标志物。
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