木糖利用组合式模块转化丰原素人工细胞的构建

作     者：高文婷 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闻建平;王福军

授予年度：2022年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：枯草芽孢杆菌 Dahms模块 乙醇醛回补TCA模块 木糖 丰原素 

摘      要：木质纤维素是自然界最为丰富的且非粮食导向的可再生资源,木糖是木质纤维素三大组成成分之半纤维素的主要水解单糖,目前有关木质纤维素的转化一直存在瓶颈,而木糖的高效利用是解决该瓶颈的有效措施,丰原素是由芽孢杆菌类合成的一种具有抑真菌、抑癌、细胞毒性功能的天然脂肽类抗生素,到目前,有关利用木糖合成丰原素的研究尚未报道。本文,主要以实验室保藏的引入调控蛋白sfp和调节因子degQ的Bacillus subtilis 168改造菌BSU00为底盘细胞,为提高木糖向丰原素合成的前体转化效率,设计引入木糖非磷酸化代谢Dahms途径功能模块,并针对Dahms途径的表达特性引入乙醇醛回补TCA循环模块以及XR-XDH模块进行代谢调控,使人工细胞在基本培养基中能够有效的转化木糖合成丰原素。首先进行非磷酸化木糖代谢Dahms模块(模块I)的制备与人工细胞的构建与表征。利用来自B.subtilis 168的强启动子P与来自Caulobacter crescentus的xyl B、xyl C和来自Escherichia coli的yjh G、yjh H完成Dahms的表达模块的制备,并先后构建了以质粒多拷贝形式进行表达的人工细胞BSU01和整合到基因组表达的人工细胞BSU02,通过分析对比M9培养基发酵的相关检测参数,以及丰原素的发酵结果,表明游离型以及整合型的单一Dahms模块人工细胞都存在不同程度的代谢压力,不利于丰原素的合成,因此需要在合成生物学的理性指导下再设计代谢模块调控Dahms途径不同模式下的表达。其次设计制备调控模块乙醇醛回补TCA模块(模块II)和XR-XDH模块(模块III),模块II分别与游离型Dahms模块表达人工细胞和整合型Dahms模块表达人工细胞BSU02组装得到双模块组合表达的人工细胞BSU03和BSU04。模块III与整合型Dahms模块表达人工细胞BSU02组装得到BSU05,通过M9培养基发酵中相关参数的变化表征乙醇醛回补TCA模块和XR-XDH模块的调控效果,同时进行丰原素的发酵,分析在调控模块与Dahms模块的组合表达人工细胞BSU03、BSU04、BSU05丰原素合成的变化。结果显示,BSU04木糖残糖量为0,且生长速率为0.27 h-1,乳酸含量为0.03 g/L,乙酸含量为0.59 g/L,丰原素的产量为50.28 mg/L,是确定的转化木糖合成丰原素的优质人工细胞。