Zymosan-A对放疗性卵巢损伤的防护效应及机制研究

作     者：余意可 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡圣芸

授予年度：2023年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 1002[医学-临床医学] 08[工学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：Zymosan-A 放射治疗 卵巢辐射损伤 生育力保留 辐射损伤防护 

摘      要：一、研究背景包括放疗在内的肿瘤综合诊疗措施的不断发展,使得肿瘤患者的生存率得到了极大的提高,也对肿瘤幸存者的生活质量提出了更高的要求。卵巢作为维持女性正常生理功能的重要器官,对放射线十分敏感,较低剂量的放射线照射就会造成严重的不良结局,包括性腺功能减退以及随之而来的生育力降低甚至丧失。越来越多的肿瘤科医生及肿瘤患者的随访人员开始致力于肿瘤患者生育力保留的宣传和研究,“Oncofertility在此境况下应运而生,并逐渐发展成新兴热门话题。目前在肿瘤患者生育力保留实践过程中的具体措施主要包含以下三类,分别是物理防护、生物防护、药物防护。物理防护因其作用有限,且不能有效避免类似于头颅放疗等影响下丘脑-垂体-性腺轴,进而影响卵巢功能,效果不甚理想。生物防护措施包括胚胎冷冻保存和移植、卵母细胞冻存和移植、卵巢组织冻存和移植及卵巢移植等,受限于技术开展的范围、技术操作的难度以及肿瘤治疗与卵巢刺激的时间冲突,乃至经济原因等,现阶段难以大范围开展。药物防护因其操作便利,时间及经济花费较少,逐渐得到了学者们的关注,并取得一定进展。在药物防护方面,目前国际上效果最佳的药物为美国制备的WR-2721,但毒性较大,副反应较多,在一定程度上限制了其的使用。国内目前的辐射损伤防治药物包括雌激素类和茜草提取物等,在实践过程中均被证实疗效不佳。正处于研究阶段的多数辐射损伤防治药物存在效应不明确、机制不清晰、毒性反应大等缺点。因此,亟需开发高效低毒的、针对电离辐射作用新靶点的药物。近15年以来,有多项研究证实了 TLRs受体及其配体在抗辐射损伤中发挥着重要作用,TLRs受体家族在抗辐射损伤研究领域得到了极大关注,逐渐成为该领域研究的新热点。前期,我们对TLRs通路相关配体进行了预实验筛选及后续的实验验证,最终得到一种靶向TLR2受体的化合物Zymosan-A,Zymosan-A中文全称酵母多糖-A,是一类通过β-1,3糖苷键连接的葡聚糖。我们的相关研究结果已经证实了其可以对肠道消化系统、骨髓造血系统发挥抗辐射损伤作用,并对其毒性进行了初步探索,未发现明显急性毒性的相关报道。关于其是否可以对卵巢发挥抗辐射损伤作用,目前国内外尚未见报道。基于此,我们将首先通过对该化合物的毒性进一步研究来验证其在动物体内的安全性,在构建出较合适的卵巢放射性损伤模型的情况下,通过一系列体内外实验来探讨Zymosan-A对放疗性卵巢损伤的防护效应研究,最后通过RNA seq筛选出Zymosan-A发挥放疗性卵巢损伤防护效应的潜在机制并初步验证,为卵巢的抗辐射损伤研究提供新的研究思路和干预途径。二、研究目的1.构建一个放射性卵巢损伤动物模型。2.系统性研究Zymosan-A对放疗致卵巢损伤的防护效应。3.对Zymosan-A发挥放疗性卵巢损伤防护效应的机制进行初步探索,筛选出潜在的放射性卵巢损伤防护作用通路。4.通过对卵巢辐射损伤防治药物研究,为育龄期女性肿瘤患者的生育力保存提供新的理论和实践支持。三、研究内容和方法1.放射性卵巢损伤模型的构建及Zymosan-A药物安全性研究(1)放射性卵巢损伤的模型构建:模拟临床盆腔放疗过程,通过给予小鼠不同剂量和/或不同次数的γ射线盆腔局部照射,一方面运用ELISA方法检测盆腔照射结束后小鼠的卵巢性激素水平,从卵巢内分泌功能层面筛选出一个较为合适的放射性卵巢损伤模型的照射剂量及照射次数。另一方面,将辐照雌鼠经促排卵后与性成熟期雄鼠合笼,通过在计数妊娠小鼠的胎儿数量从卵巢生殖功能层面筛选出一个较为合适的放射性卵巢损伤模型的照射剂量及照射次数。结合上述两方面结果,综合评估,筛选出一个合适的照射剂量及照射次数,构建一个放射性卵巢损伤动物模型。(2)Zymosan-A药物安全性研究:查阅文献了解既往相关研究所用的药物浓度,腹腔注射同等剂量的该药物,通过ELISA方法检测给药后小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶水平来评估该药物的肝脏毒性,通过检测小鼠血清肌酐值来评估该药物的肾毒性,并在小鼠卵巢内分泌及生殖功能层面开展相关研究来评估其生殖毒性。2.Zymosan-A对放疗性卵巢损伤的防护效应研究(1)Zymosan-A对辐照后小鼠卵巢组织重量及卵巢器官系数的影响:辐照前给予小鼠腹腔注射Zymosan-A,在辐照后某一时间点称量各组小鼠的卵巢湿重及小鼠体重。(2)Zymosan-A对辐照后小鼠动情周期的影响:辐照前给予小鼠Zymosan-A预处理,在辐照后对各组小鼠进行阴道脱落细胞学检查。(3)Zymosan-A对辐照后小鼠卵巢激素水平的影响:在辐照前给予小鼠腹腔注射Zymosan-A,通过ELISA方法检测辐照后各组小鼠的卵巢性激素水平变化。(4)Zymosan-A对辐照后小鼠卵巢卵泡成熟的影响:辐照前给予小鼠Zymosan-A预处理,在辐照后某一时间点通过解剖得到小鼠卵巢组织,通过对小鼠卵巢组织HE切片上各级卵泡数量计数,并统计总卵泡数量。(5)Zymosan-A对辐照后小鼠卵巢生殖功能的影响:辐照前给予小鼠腹腔注射Zymosan-A,辐照结束后将雌鼠经促排卵后与性成熟期雄鼠合笼,在妊娠后某一时间点解剖小鼠子宫,计数各组小鼠子宫内胚胎数量。(6)Zymosan-A对辐照后小鼠子代体重的影响:在辐照前给予小鼠腹腔注射Zymosan-A,在辐照后将雌鼠经促排卵后与性成熟期雄鼠合笼,在出生后多个时间点称量各组小鼠后代的体重。(7)Zymosan-A对辐照后小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响:在照射前给予细胞Zymosan-A预处理,在辐照后运用CCK-8检测小鼠卵巢颗粒细胞的增殖情况。(8)Zymosan-A对辐射后小鼠卵巢颗粒细胞存活率的影响:在照射前给予细胞Zymosan-A预处理,在辐照后某一时间点统计细胞克隆形成数量。(9)Zymosan-A对辐射后小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响:在照射前给予细胞Zymosan-A预处理,在辐照后某一时间点通过流式细胞术来统计各组细胞凋亡情况。3.Zymosan-A发挥放疗性卵巢损伤防护效应的初步机制探讨(1)Zymosan-A发挥放疗性卵巢损伤防护效应的差异基因筛选:辐照前给予小鼠腹腔注射Zymosan-A,在辐照后某一时间点解剖得到小鼠卵巢组织,并进行高通量测序。(2)通过构建TLR2KO(Knockout)小鼠,并在TLR2KO小鼠体内开展研究验证TLR2受体在放射性卵巢损伤防护中的作用。(3)差异表达基因的KEGG功能富集分析:通过在公共数据分析平台按照操作指南对前述差异基因进行KEGG分析。(4)卵巢组织测序结果相关差异表达基因的定量PCR验证:在辐照前给予小鼠腹腔注射Zymosan-A,辐照后某一时间点解剖得到小鼠卵巢组织并进行RNA抽提,按照RT-PCR操作指南完成相关筛选出来的差异基因表达量的验证。(5)靶向TLRs通路及NF-κB通路相关蛋白表达量验证:在辐照前给予小鼠腹腔注射Zymosan-A,辐照后某一时间点解剖得到小鼠卵巢组织并进行蛋白提取,运用Western-blot方法评估相应蛋白表达量。四、研究结果1.放射性卵巢损伤模型的构建及Zymosau-A药物安全性研究(1)通过在小鼠卵巢内分泌功能层面及生殖功能层面开展研究,并对两部分结果综合分析,初步证实了小鼠卵巢放射性损伤模型适当的造模条件为2Gy单次盆腔局部照射。(2)前期相关辐射损伤防护研究开展过程中所用的Zymosan-A给药条件:小鼠(50mg/kg)、细胞(40ug/mL)均较为适宜。2.Zymosan-A对放疗性卵巢损伤的防护效应研究(1)与单纯辐照组相比,Zymosan-A照射前给药会增加小鼠卵巢组织重量及卵巢器官系数,且两组间存在统计学差异。(2)Zymosan-A的单纯给药不会引起小鼠的动情周期紊乱,在照射前给予小鼠腹腔注射Zymosan-A,其动情周期总体紊乱率显著低于单纯辐照组。(3)在照射前通过腹腔注射给予小鼠Zymosan-A,在辐照后该组小鼠的卵巢雌激素(E2)及抗缪勒管激素(AMH)水平较单纯辐照组显著升高,且卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)水平显著降低。(4)辐照诱发小鼠卵巢卵泡成熟障碍,与单纯辐照组相比,照射前应用Zymosan-A可降低闭锁卵泡数量,增加原始卵泡、初级卵泡、窦前卵泡和窦卵泡、总卵泡数量。(5)在小鼠生殖功能评估上,与单纯辐照组相比,Zymosan-A的预处理会增加小鼠的妊娠率;同时,对妊娠后小鼠的胚胎计数结果显示,Zymosan-A的照前使用会使其数量明显增加。(6)辐照前应用Zymosan-A的母代,其子代出生后第3天、第5天、第7天体重均较单纯辐照组后代体重明显升高,且该趋势在出生后第42天体重统计上也一致。(7)Zymosan-A会增加辐射后小鼠卵巢颗粒细胞的增殖率,与单纯辐射组相比,二者间存在统计学差异。(8)Zymosan-A会增加辐射后小鼠卵巢颗粒细胞的存活率,在各个剂量的辐照组中,Zymosan-A预处理组克隆形成率较单纯辐照组均明显升高。(9)Zymosan-A会降低辐射后小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡率,辐照给药组小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡率约为单纯辐照组的一半。3.Zymosan-A发挥放疗性卵巢损伤防护效应的初步机制探讨(1)Zymosan-A给药组小鼠卵巢组织测序与单纯辐照组共筛选出差异基因268个,其中有156个基因上调,有112个基因下调。(2)上调差异基因最显著的是Tlr2。(3)相较于单纯辐照组小鼠,TLR2KO辐照组小鼠卵巢性激素紊乱程度及生殖功能障碍更重,且TLR2 KO能逆转Zymosan-A对辐照小鼠卵巢性激素水平紊乱的改善作用及生殖障碍的改善作用。(4)Zymosan-A对放疗性卵巢损伤发挥防护效应可能主要是通过靶向Toll-like receptor signaling pathway 及 NF-kappa B signaling pathway 产生作用。(5)与单纯辐照组相比,靶向 Toll-like receptor signaling pathway 及 NF-kappa B signaling pathway中部分表达差异基因,包括Tlr2、Ccl5、Ccl3、Akt1、Myd88及Ikbkb的基因表达量均上调,且存在统计学差异。(6)进一步关于靶向TLRs通路及NF-κ B通路相关蛋白的表达量的验证结果显示,辐照给药组较单纯辐照组相关蛋白表达量均明显升高。五、研究结论本研究前期通过文献调研及配体筛选,从大量TLRs配体中筛选出一种高效低毒的抗辐射药物Zymosan-A,初步的毒性研究提示其动物实验毒性较低。目前国内外在放射性卵巢损伤研究中使用的动物模型及造模条件差异性较大,故本研究的开始通过在小鼠卵巢内分泌功能层面及生殖功能层面开展研究,构建一个操作性较稳定的放射性卵巢损伤动物模型,为后续的研究开展提供了支持。在开展具体的卵巢辐射损伤防护效应研究之前,我们首先对其毒性进行了更为具体的相关验证。在明确了其安全性之后,通过在小鼠及小鼠卵巢颗粒细胞中开展研究,证实了 Zymosan-A可以对放射性卵巢损伤发挥防护效应。最后通过对单纯辐照组及辐照给药组小鼠卵巢组织进行RNA测序分析,筛选出两条潜在的卵巢辐射损伤防护作用通路,并通过RT-PCR及Western-blot实验进行了初步验证。通过该研究的开展,为放疗性卵巢损伤构建了一个相对动物模型,同时为放疗性卵巢损伤防护找寻到了一种潜在的防护剂及潜在的作用通路。