重症肌无力胸腺细胞α7烟碱样乙酰胆碱受体的表达及其对T细胞增殖和细胞因子水平的影响研究

作     者：黄玉炜 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张清勇

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：重症肌无力 细胞因子 非神经元型胆碱能系统 α7烟碱样乙酰胆碱受体 

摘      要：背景与目的:重症肌无力(myasthenia gravis,MG)以神经-肌肉接头为靶点,是对T细胞依赖、依靠补体支持的获得性自身免疫性病变,主要由抗乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,ACh R)抗体所引起。胸腺是MG自身异常免疫应答反应的重要场所,研究表明有百分之八十左右的MG患者可有胸腺组织异常,其病理形式主要包括胸腺增生以及胸腺瘤。胸腺切除术对MG临床症状的长期改善得到了逐步认可,已成为MG常见的治疗方式。MG的发病机制尚未明确,但我们已经得知,T细胞在MG的发病中发挥重要作用,CD4T细胞和CD8T细胞各亚型表达比例失衡及其相关细胞因子的异常分泌可促使MG的发生发展,一些研究表明其特征为TNF-α、IL-17、IL-21的反应性分泌增加,且代表部分T辅助细胞的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10也已被证实在MG的发生发展中不容忽视。非神经元型胆碱能系统(non-neuronal cholinergic system,NNCS)广泛存在于各种生物的非神经细胞和组织中,其胆碱能系统组分有烟碱型受体(nAChR,α1-α10、β1-β4、γ)和毒蕈碱型受体(m ACh R,M1-M5),还包括合成乙酰胆碱的胆碱乙酰转移酶(Choline acetyltransferase,Ch AT)、分解乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,Ach E)等。该系统参与调节免疫反应,并在维持体内免疫平衡方面发挥至关重要的作用,其中α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7 type nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR)介导的抗炎效应是近年来的研究热点。7 nAChR是在免疫细胞和线粒体表面发现的一个nAChR亚家族,它与免疫细胞上的受体结合,介导抗炎因子的交叉对话。已有研究表明MG外周血细胞因子的异常分泌可能与α7 nAChR相关,但仍需进一步探究胸腺T细胞及相关细胞因子与α7 nAChR不同表达水平之间的相关性。本研究通过检测MG胸腺细胞中α7 nAChR的表达,并在T细胞活化的基础上,使用α7 nAChR激动剂和拮抗剂进行干预,探究α7 nAChR与MG胸腺功能异常潜在相关性,探讨α7 nAChR对T细胞增殖及相关细胞因子表达水平的影响,为后续研究奠定基础,也可能为MG的治疗策略提供更多思路。资料和方法:1.一般资料选取2021年6月至2022年6月河南省人民医院重症肌无力综合诊疗中心收治的重症肌无力(未合并胸腺瘤)患者共计10例作为MG组,其均在胸腔镜下行胸腺扩大切除术,其中男性3例,女性7例,年龄在13-30岁,平均(19.25±6.28)岁;选取河南省人民医院心脏中心2021年6月至2022年9月收入院,行心脏手术过程中为暴露术野行部分胸腺切除的患者15例作为对照组,男性6例,女性9例,年龄20-35岁,平均(26.18±6.77)岁。两组患者在年龄、性别比例方面均无统计学差异。2.实验方法制备MG患者组及对照组胸腺单细胞悬液,采用实时荧光聚合酶链式反应(q RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)来检测MG患者组(n=10)及对照组(n=15)胸腺细胞中α7 nAChR的表达情况。使用CD3/CD28单抗偶联磁珠诱导MG组及对照组胸腺T细胞活化,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测两组胸腺细胞中细胞因子干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、肿瘤坏死因-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21水平。而后按处理方式不同,将活化的MG组胸腺T细胞分为α7nAChR拮抗剂组、α7 nAChR激动剂组和空白对照组,将胸腺单细胞悬液培养72h后采用ELISA对上清液中的IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21表达水平进行检测。之后加入CD4-PE抗体、CD8-APC抗体,采用流式细胞术检测MG患者胸腺T细胞亚群增殖情况。3.统计学方法应用SPSS25.0软件进行统计学研究,对测量数据采用均数±标准差(x±s)的方式描述,对测量数据两组间的对比均使用t检验,对于不满足正态分布的测量数据则使用非参数秩和检验。以P0.05)。与空对照组相比,胸腺T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-21的水平在α7 nAChR拮抗剂组有所增加(P0.05);α7 nAChR激动剂组的CD4+T和CD8+T细胞计数明显低于空对照组和α7nAChR拮抗剂组(P0.001),而α7 nAChR拮抗剂组的CD4+T和CD8+T细胞计数则明显高于空对照组(P0.001)。结论:1.α7 nAChR在MG患者胸腺细胞中表达降低;2.胸腺细胞中α7 n Ach R的激动与拮抗的研究表明,MG患者的胸腺细胞中α7n Ach R的表达存在免疫抑制效果;3.α7 nAChR可能通过调控MG胸腺T细胞增殖并影响细胞因子分泌,控制炎症反应,进而参与胸腺功能异常的调节。