吕氏泰勒虫基因组特征分析及动物宿主感染调查研究
作者单位：山东大学
学位级别：硕士
导师姓名：曹务春;赵琳;丁淑军
授予年度：2023年
主 题：泰勒虫 全基因组分析 荧光原位杂交 系统进化分析 共感染
摘 要：研究背景泰勒虫病是由严格细胞内寄生的原生生物泰勒虫引起的一种梨形虫病。泰勒虫广泛分布于世界各地,有多种动物宿主,包括家养和野生动物,给畜牧业发展造成了巨大负担。已知莱氏泰勒虫和吕氏泰勒虫具有较高的致病性,尤其是对宿主山羊影响较大,由于山羊多为个体户散养,所以羊泰勒虫感染对个体家庭来说将面临巨大的经济危机。同时,一些新发现的泰勒虫物种可能在世界不同地区的各种家养和野生动物中流行并引发疾病,对兽医卫生和畜牧业经济增长构成重大威胁。目前虽然已经鉴定出了较多的泰勒虫物种,但迄今为止只有四个泰勒虫物种的基因组可用,这限制了我们进一步了解其分子特征,阻碍了我们对泰勒虫物种遗传学和致病机制的理解。此外,泰勒虫常常与其他蜱传病原体存在共同感染的情况,多重病原体感染将在一定程度上增加宿主发病的风险。研究目的本研究旨在探索山东地区是否有新泰勒虫存在;了解新发泰勒虫的基因组特征;进一步调查新发泰勒虫在宿主动物中的分布,从而预判调查地区病原体对畜牧卫生健康与经济的威胁;同时探索泰勒虫与其他蜱传病原体共感染情况,为蜱传病原体的防控提供科学实验依据。研究方法山东省采样点是根据本课题组之前对蜱传病原体的监测和调查锁定的。根据课题组之前现场调查的经验,圈养的山羊几乎没有机会能够感染蜱虫。本研究采集的血液样本均选取放养的、受蜱虫侵害的山羊,整个采样过程符合生物安全准则,方法为颈静脉采血,每只羊采取一份抗凝血。羊血样本运输至实验室后,一方面将血液样本中红细胞富集后进行高通量测序,另一方面提取样本DNA,进行PCR与琼脂糖凝胶电泳检测,并进行基因序列的测定与系统进化树的构建。血液样本制作血涂片进行瑞氏-姬姆萨染色和荧光原位杂交实验(Fluorescence in situ hybridization,FISH)。全基因组分析包括基因组组装和质量评估,全基因组进化树的构建,蛋白质预测和注释,进化时间分析与基因家族的收缩扩张。共感染实验主要通过FISH进行可视化验证。研究结果1.于山东省受感染山羊血液中发现存在泰勒虫,并通过基因组组装获得了完整的基因组序列,并且该泰勒虫物种的全基因组序列尚未被发表。细胞内寄生虫的全基因组组装通常受到宿主细胞DNA的极大干扰,考虑到泰勒虫多通过瑞氏-姬姆萨染色在红细胞中观察到,本研究首先从受感染的山羊血液中分离红细胞并将其裂解,以最大限度地去除山羊DNA。在进行二代测序后,进一步丢弃剩余的山羊基因组序列,成功地从感染山羊中组装得到了一个泰勒虫的全基因组序列。本研究将该株泰勒虫命名为吕氏泰勒虫齐鲁株(Theileria luwenshuni str.Cheeloo)。这是世界上得到的泰勒虫物种的第五个全基因组序列,基因完整性达94.47%。吕氏泰勒虫基因组序列的系统发育分析和与其他泰勒虫物种的基因组特征比较分析共同表明Theileria luwenshuni str.Cheeloo与其他4个泰勒虫物种是不同的,其与东方泰勒虫的亲缘关系最近。此后,通过FISH实验进一步证实了山羊血样中存在吕氏泰勒虫,并观察到吕氏泰勒虫在红细胞内形态多样,有棒状、卵形、梨籽形等多种形态。2.经过与其他四个已经发表全基因组序列的泰勒虫物种相比,吕氏泰勒虫的基因组最小,基因家族的收缩与扩张也最少。此外,在真核生物的直系同源分类注释中,吕氏泰勒虫与东方泰勒虫的蛋白质数量基本相当,但基因组大小存在显著差异。吕氏泰勒虫在基因本体论(Gene Ontology,GO)注释第3级的大多数分类中,基因数量均低于其他四个物种;此外本研究使用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)注释及分析结果显示,在吕氏泰勒虫中c-Myb基因是缺失的。3.基于其18S rRNA和cox1基因的系统发育分析显示,吕氏泰勒虫的基因多样性较低,并且其与宿主小反刍动物之间存在共同进化。进一步的流行病学调查表明,吕氏泰勒虫在山东省的山羊中具有较高的流行率。在山东省调查的3群54只山羊中,吕氏泰勒虫的感染率高达81.5%。4.通过血涂片瑞氏-姬姆萨染色和FISH实验验证山东省所采血样中是否存在吕氏泰勒虫与无形体的共感染。瑞氏-姬姆萨染色结果显示成熟红细胞内的蓝色深染颗粒为疑似病原体,均分布在红细胞上。FISH结果显示泰勒虫被标记为绿色,呈梨籽形或杆状,泰勒虫的细胞核被染成蓝色;无形体被标记为红色,呈圆形或点状;强荧光范围均局限在红细胞内;红细胞表现为相对弱的非特异性荧光。研究结论1.本研究发现并组装得到了一个泰勒虫的全基因组序列,经过序列比对发现该泰勒虫与吕氏泰勒虫相似,但由于吕氏泰勒虫尚未有全基因组序列发表,因此我们将其命名为吕氏泰勒虫齐鲁株。并且通过瑞氏-姬姆萨染色和荧光原位杂交进一步证实了泰勒虫的存在,实现了在荧光显微镜下对该病原体的特异性识别,将病原体的形态直观准确地展现出来。为后期泰勒虫研究的快速特异性检测提供了新思路。2.本研究解析了吕氏泰勒虫的基因结构,并通过与小泰勒虫、东方泰勒虫、马泰勒虫和环形泰勒虫进行比较基因组学分析发现吕氏泰勒虫的基因组大小是最小的,并且有三个特有的功能未知的Orthogroups。此外,吕氏泰勒虫与东方泰勒虫和小泰勒虫有更多共有的基因,而这些基因在其他两个泰勒虫物种中不存在。在进化距离和时间上,吕氏泰勒虫和东方泰勒虫比其他三个泰勒虫物种更近,这可能解释了它们共享更多的蛋白质编码基因的原因。而吕氏泰勒虫在GO注释的3级细胞成分分类中,涉及膜结合细胞器、细胞器和胞内细胞器的蛋白质编码基因比其他4个泰勒虫物种少。这些分析结果将提高我们对吕氏泰勒虫齐鲁株基因功能的认识。KEGG注释显吕氏泰勒虫齐鲁株中缺乏c-Myb,这表明与其他泰勒虫物种相比,它在凋亡、增殖和分化方面可能具有不同的机制。3.通过对山东省泰勒虫的流行病学调查发现,在山东省采集的样本中吕氏泰勒虫具有较高的感染率。本研究一定程度上补充了该种能够感染山羊的泰勒虫物种在中国的流行病学调查,从进化树发现吕氏泰勒虫的进化与小反刍动物的进化相一致。本研究的结果对研究和控制泰勒虫病极为重要。4.本研究通过原位杂交技术将泰勒虫与无形体的共感染情况以一种更加特异,更加直观的方式展现出来,实现了在同个视野中显示不同颜色的多个病原体。这在一定程度上提高了泰勒虫与无形体共感染研究的准确性和特异性,对山东地区的蜱传病原体防控提供了科学实验依据,同时也强调了提升山羊养殖管理方式和公共卫生安全的重要性。
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