吡蚜酮和丙草胺单克隆抗体的制备及ELISA方法的建立
作者单位：华中农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：彭大鹏
授予年度：2023年
学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护]
摘 要：吡蚜酮(Pymetrozine,PY),三嗪酮类杀虫剂,对蚜虫科、飞虱科、粉虱科、叶蝉科害虫的防治效果优异,可用作叶面喷雾和土壤处理。丙草胺(Pretilachlor,PR),高选择性除草剂,适用于水稻防除禾本科和阔叶杂草,水稻可以分解PR。这两种药物在农业生产中使用广泛,会引起水体环境污染,对渔业造成重大损失,通过食物链富集作用进入人体引发癌症等危害。关于这两种药物的残留检测研究报道较少,液相色谱法为主要检测技术,该方法操作复杂、检测成本高,会产生大量有机试剂废液。基于抗原与抗体特异性结合的免疫快速分析法,尤其是酶联免疫吸附测定法(ELISA),具有操作简单、检测成本低、较少产生有机溶剂废液,灵敏度高和特异性能够到达甚至超越色谱分析方法,适合残留检测监控中的筛选分析和现场检测,是如今残留检测领域的主流技术和方法。当前有关于这两种药物的ELISA检测技术鲜有研究,建立食品中检测PY和PR的间接竞争ELISA检测方法(ic-ELISA),检测食品中相应药物残留含量,为食品安全提供保障是十分重要的。本研究通过半抗原的设计和抗原合成,最终获得两种能够分别识别PY和PR的单克隆抗体(m Ab)。基于这两种抗体,建立了相应的酶联免疫检测方法,并应用于西兰花、卷心菜、小麦、玉米、大米、鸡肉、鱼、小龙虾和湖水等样品的残留检测,主要研究结果如下:1.以氨基三嗪酮盐酸盐和5-甲酰烟酸为原料合成带有羧基的吡蚜酮半抗原(PYC);以丙草胺和3-巯基丙酸为原料合成带有羧基的丙草胺半抗原(PR-SC)。采用活化酯法将PYC和PR-SC分别与载体蛋白偶联制备免疫原PYC-BSA和PR-SC-BSA,以及包被原PYC-OVA和PR-SC-OVA,其偶联比分别为10.8、15.4、7.9、10.2。2.分别将PYC-BSA和PR-SC-BSA免疫雌性Balb/c小鼠,经过血清检测各选出3只小鼠进行细胞融合。经过细胞筛选获得了两株杂交瘤细胞株PY/2D2-D8和PR/114。3.吡蚜酮ic-ELISA方法建立:基于细胞PY/2D2-D8获得的mAb,经鉴定抗体的亚型为Ig G。Ic-ELISA方法经优化后,发现PYC-OVA最佳包被原浓度为0.25μg/m L,最佳抗体浓度2μg/m L,磷酸盐缓冲液(PBS)做为PY的稀释液时灵敏度最高;标准曲线的回归方程为Y=0.87209-0.37919X,R=0.9961,IC值为9.58±0.60μg/L,线性范围为2.5-40μg/L。该抗体对苯嗪草酮、环嗪酮、嗪草酮、啶虫脒、烯啶虫胺、吡虫啉均无交叉反应。PY在西兰花、卷心菜、小麦、玉米、大米、鸡肉、鱼、小龙虾和湖水样品中的检测限为1.56-2.72μg/L,定量限为2.95-6.57μg/L,回收率为78.2%-103.1%,变异系数小于12.3%。4.丙草胺ic-ELISA方法建立:基于细胞PR/114获得的m Ab,经鉴定抗体的亚型为Ig G。经ELISA方法优化后,发现PR-SC-OVA最佳包被原浓度为0.0625μg/m L,最佳抗体浓度1μg/m L;以含5%甲醇的PBS作为竞争药物的稀释溶液,ELISA方法的灵敏度最高。标准曲线的回归方程为Y=1.08288-0.387X,R=0.9915,IC值为31.47±2.35μg/L,线性范围为6.25-100μg/L。该抗体对甲草胺、乙草胺、甲霜灵和吡氟酰草胺均无交叉反应;对丁草胺、异丙草胺的交叉反应率小于2.0%。在检测湖水、大米、土壤样品中的PR时需要对样品进行10倍稀释,实际样品的线性范围为62.5-1000μg/L,检测限为48.3-52.3μg/L,定量限为101.3-109.8μg/L,回收率为78.3%-91.3%,变异系数小于9.5%。5.PY/2D2-D8抗体、PR/114抗体、PYC-OVA包被原和PR-SC-OVA包被原经过稳定性试验,发现都可在4℃下能够保存12个月,PY标准溶液能保存8个月,PR标准溶液在4℃能保存2个月。本研究设计与合成的吡蚜酮半抗原的为独创研究,制备的两种m Ab,能够分别识别PY和PR,基于此建立了食品中PY和PR提取方法和ic-ELISA检测方法,经液相色谱检测技术验证其可靠性。研究所得成果弥补了PY免疫检测方法的空白,为PR免疫检测领域提供了一种更加灵敏的检测方法,为食品安全提供监督手段,具有较高的应用价值和前景。
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