原发和复发性cSCC单细胞图谱绘制及MDK对cSCC的调控作用研究

作     者：卞小慧 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：印明柱

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：皮肤鳞状细胞癌 单细胞测序 肿瘤微环境 中期因子 

摘      要：皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,c SCC)是第二常见的非黑色素瘤皮肤肿瘤,其能突破基底膜,具有较强的侵袭和转移能力,因此,小部分c SCC病例会出现复发和转移,并导致死亡。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)决定肿瘤的进展、转移和治疗反应。因此,有必要描述c SCC TME中细胞的异质性和功能状态。在本研究中,我们通过单细胞RNA测序技术(single-cell RNA sequencing,sc RNA-seq)首次揭示了原发性和复发性c SCC之间的异质性以及c SCC复发的肿瘤微环境的主要组成细胞的独特的单细胞图谱,同时提出了从光化性角化病到原发性c SCC,最后进展到复发性c SCC中期因子(midkine,MDK)的特定转化模式,并证实了MDK可能通过激活MAPK/ERK信号通路促进c SCC发生发展的新机制,为靶向MDK治疗c SCC提供了一个潜在策略和依据。研究方法(1)收集诊断为原发性或复发性c SCC的患者的肿瘤组织和邻近的正常皮肤(adjacent normal skin,ANS)分离单个细胞,进行单细胞捕获,c DNA文库构建、高通量测序以及原始数据处理分析;(2)结合无监督聚类分群及经典细胞标记基因明确c SCC中TME细胞分群,分析组间各群细胞比例变化;(3)对上皮细胞进行亚群分析、聚类分析、RNA速率分析、功能富集分析、“癌症特征相关的功能术语的活动评分;(4)比较原发性和复发性c SCC之间肿瘤特异性角质形成细胞(tumor-specific keratinocytes,TSK)中差异表达的基因,并通过免疫组化染色进行验证;(5)对T细胞进行亚群分析、RNA速率分析、聚类分析、耗竭评分、炎症通路评分;(6)对髓系细胞进行亚群分析、RNA速率分析、Cyto TRACE分析、炎症通路评分、c MAP活性评分,并进行血管生成和吞噬特性分析;(7)对成纤维细胞进行亚群分析、RNA速率分析、炎症通路评分;(8)对原发性和复发性c SCC进行细胞间通讯分析,比较MDK相关相互作用关系,并通过免疫组化染色验证不同样本中MDK的表达;(9)构建人皮肤鳞癌细胞A431过表达和敲降MDK的细胞株,并通过实时定量PCR和Western Blot验证效率;(10)通过CCK8、平板克隆形成、Transwell实验检测MDK对A431细胞增殖、侵袭和迁移的影响;(11)将在A431细胞系中构建的MDK敲降、MDK过表达及其相应对照组进行RNA-seq测序,分析差异表达基因并进行功能富集分析;(12)通过Western Blot验证A431细胞系中构建的MDK敲降、MDK过表达及其相应对照组的ERK1/2及其磷酸化表达水平。研究结果(1)我们共收集到9例组织样本,包括4例原发性c SCC的肿瘤组织、1例复发性c SCC的肿瘤组织、3例邻近的正常皮肤组织、1例鲍温病(Bowen disease,BW)肿瘤组织。通过数据质控和细胞过滤,共获得14,626个高质量细胞,并通过无监督聚类方法确定了7种主要细胞类型,包括上皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞、T细胞、内皮细胞、肥大细胞和B细胞。其中,原发性c SCC含有最高比例的上皮细胞、髓系细胞、T细胞、内皮细胞、肥大细胞,复发性c SCC含有相对较高比例的成纤维细胞和B细胞,而BW组织中细胞比例最低;(2)上皮细胞分为4个亚群:Basal上皮细胞、Cycling上皮细胞、Differentiation上皮细胞和TSK。ANS和BW中Differentiation上皮细胞占比最高,而原发性和复发性c SCC中TSK占比较高。RNA速率分析提示Basal上皮细胞和Differentiation上皮细胞倾向于分化为TSK,且TSK在大多数癌症特征相关的活动评分中得分最高。EMT相关标记基因VIM和TGFB1在复发性c SCC中表达上调,且复发性c SCC的EMT分数明显更高;(3)T细胞分为5个亚群:效应CD4T细胞、Tregs细胞、初始CD4T细胞、效应CD8T细胞和CD8细胞毒性T细胞。Tregs细胞与效应CD4T细胞、效应CD8T细胞与CD8细胞毒性T细胞存在双向分化。复发性c SCC表现为T细胞低浸润,耗竭评分更高、炎症通路评分较低;(4)髓系细胞分为10个群,标记出4类细胞,包括肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)(4群)、单核细胞(1群)、DCs细胞(3群)、MDSCs细胞(2群)。复发性c SCC富含CXCL9-11MDSCs细胞。RNA速率分析提示TAMs、DCs细胞倾向于分化为单核细胞,而MDSCs细胞位于分化轨迹的末端。复发性c SCC中髓系细胞炎症通路评分较低。复发性c SCC中的SPP1TAMs具有较低的吞噬作用和炎症活性,但血管生成能力较高;(5)成纤维细胞分为3个亚群:m CAFs、i CAFs和IL7RCAFs。RNA速率分析提示i CAFs可分化为m CAFs和IL7RCAFs。复发性c SCC中IL7RCAFs炎症通路评分较低。IL7RCAFs在collagen、FN1和TEAD信号通路中与TSK的相互作用最强;(6)细胞间通讯分析提示在原发性c SCC中,i CAFs和IL7RCAFs分泌高水平的MDK以介导其细胞间通讯,而在复发性c SCC中,TSK分泌高水平MDK,介导与自身及其他细胞的强烈的细胞间通讯;(7)光化性角化病(actinic keratosis,AK)皮下组织中VIM、MDK表达上调,且二者呈正相关;(8)复发性c SCC组织的MDK表达水平均显著高于原发性c SCC,且与VIM和TGFB1的表达显著相关;(9)敲降MDK可显著抑制皮肤鳞癌细胞A431的增殖、侵袭和迁移,而过表达MDK可促进皮肤鳞癌细胞A431的增殖、侵袭和迁移;(10)A431细胞系中构建的MDK敲降、MDK过表达及其相应对照组的RNA-seq测序结果提示敲降组和过表达组之间有32个基因表达水平共同发生变化,对32个基因进行KEGG功能富集分析,提示PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Erb B信号通路、MAPK信号通路等变化较为明显;(11)敲降MDK后抑制ERK1/2磷酸化表达水平,而过表达MDK则增强ERK1/2磷酸化表达水平。结论(1)复发性c SCC中主要表现为免疫抑制的微环境,包括T细胞低浸润,T细胞耗竭增加和SPP1TAMs富集;(2)在原发性c SCC中,MDK可以介导i CAFs和IL7RCAFs强烈的细胞间相互作用。而在复发性c SCC中,TSK倾向于通过分泌MDK来与自身产生强烈的相互作用,以及同IL7RCAFs表达的EMT相关标记物相互作用,从而驱动复发性c SCC中肿瘤细胞增殖和EMT;(3)MDK可能通过激活MAPK/ERK信号通路促进c SCC的增殖、侵袭和迁移。图28幅,表3个,参考文献76篇