LsSPX调控莴苣磷饥饿信号转导的机理研究及LsPHYB基因的功能研究

作     者：赵丽媛 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈炯炯

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：莴苣 LsSPX 磷胁迫 LsPHYB 花青素 

摘      要：磷(Phosphorus)是植物健康生长发育所必需的元素。植物在生长过程中常会遇到磷供应不足的现象。为应对低磷环境,植物形成了一套复杂而高效的应答机制。有研究表明SPX基因家族在磷酸盐饥饿中起着重要作用,但在莴苣(Lactuca sativa)中该家族是否有类似的功能,仍然未知。采用水培法测定正常磷(0.5 mmol/L)和缺磷(0 mmol/L)7 d下莴苣幼苗的叶片大小、花青素含量、地上部分和根部的矿质元素浓度。结果表明磷缺乏抑制了莴苣幼苗生长发育,缺磷会使莴苣幼苗叶片显著变小,叶片变红。缺磷抑制了植株的地上部分和根部Pi、K、Ca、Na的积累,增加了Al、Fe、Zn的积累。对缺磷胁迫的转录组数据进行分析,结果表明缺磷会上调LsCHS等花青素合成过程中结构基因的表达量而造成花青素的积累,MYB类等转录因子也参与到磷胁迫中,具有SPX结构域的LsSPX基因在缺磷处理后表达量上调。通过在莴苣基因组中Blast得到获得整个LsSPX家族的基因,对地上部分和根部的LsSPX基因进行RT-PCR分析,结果表明在缺磷处理7 d后,地上部分除LsSPX1-3外,其余5个LsSPX基因均被显著诱导,而根部的LsSPX1-3和LsSPX3都不响应磷饥饿。分析LsSPX基因的启动子区域的顺式作用元件,发现其富含有参与逆境、生长、代谢响应的元件,表明LsSPX很可能通过这些途径来响应磷饥饿。亚细胞定位表明LsSPX1-1、LsSPX1-2、LsSPX2都定位在细胞核上。这些发现可以拓宽对莴苣中SPX家族生物学功能的理解,并为进一步研究该家族在植物中的应用提供基础。本研究构建了LsSPX基因的敲除载体和超量表达载体,并进行转基因实验,获得了LsSPX2的超量表达植株。LsSPX2-OE#5植株的主根明显伸长,且缺磷处理7 d后叶片更红。对LsSPX2-OE#5和对照植株进行q RT-PCR分析,数据表明在地上部分,LsSPX2上调了LsSPX1-2、LsSPX4的表达,但下调了LsSPX3的表达。在根部,LsSPX2上调了LsSPX1-1、LsSPX1-2、LsSPX3、LsSPX4表达。表明LsSPX2会通过调控其他LsSPX的表达来响应磷饥饿,且地上部分和根部不尽相同。转录组数据分析结果表明LsMYB12参与磷胁迫。LsMYB12-OE植株q RT-PCR数据表明,在地上部分,LsMYB12上调了LsSPX1-2、LsSPX2、LsSPX3、LsSPX4的表达量来适应磷饥饿。在根部,LsMYB12会上调LsSPX1-2、LsSPX3,但LsSPX3在根部不响应磷饥饿。表明LsMYB12参与到LsSPX介导的磷饥饿。莴苣的茎表皮有红色和绿色的颜色分离,实验室前期通过精细定位、结构分析及功能预测初步推测光敏色素B(Phytochrome B)为候选基因。并对该基因进行基因编辑以验证其功能。本课题选用LsPHYB功能正常的紫烟莴苣为受体,进行基因编辑,获得Lsphyb-Cr#5株系。同时也观察了T代植株Lsphyb-Cr#6、21、22表型。Lsphyb-Cr#5、6、21、22茎表皮颜色变为绿色,确定LsPHYB是控制茎表皮颜色基因。进一步观察基因敲除的Lsphyb转基因植株,发现LsPHYB除控制茎的表皮颜色外,在莴苣中还有着非常强大的功能。LsPHYB会抑制下胚轴伸长及花青素在下胚轴的积累。LsPHYB的功能丧失突变会导致莴苣叶夹角变小,叶片变大,且叶片颜色变淡。同时,LsPHYB突变功能丧失后使莴苣提早抽薹、茎变粗,花期推迟、植株变高。通过对LsPHYB功能正常的植株和Lsphyb-Cr植株的茎表皮提取RNA,将RNA-seq数据进行分析。发现MYB类转录因子、b HLH家族的转录因子的转录水平发生了显著的变化。综上所述,LsPHYB通过调控MYB类以及b HLH类转录因子表达量的变化,从而影响花青素的合成。以上研究结果有助于揭示LsPHYB调控花青素合成的分子机制。