牛病毒性腹泻病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法及攻毒模型的建立

作     者：王亚新 

作者单位：内蒙古农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王凤雪

授予年度：2023年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛病毒性腹泻病毒 持续性感染牛 5’UTR 实时荧光定量PCR 攻毒模型 

摘      要：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是导致牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的主要病原之一,各年龄段牛皆易感,在世界范围内广泛传播。BVDV感染可表现多种肠道和呼吸道症状,亚临床感染可能伴随继发性疾病,易感繁殖母牛感染后出现生殖系统疾病,垂直传播导致产出持续性感染(PI)牛,BVDV的感染可能是亚临床的,也可能继发感染而发展为严重的致命疾病。在妊娠前三个月子宫内感染存活下来的胎牛几乎都是持续性感染小牛。PI牛作为BVDV的主要宿主,并可以通过尿液、粪便、排泄物、牛奶和精液排出大量病毒,对养牛业危害严重,尽早筛查PI牛是防控BVDV的关键因素。本研究针对BVDV的5’UTR设计特异性引物及探针,对BVDV 5’UTR进行扩增,进而构建阳性重组质粒建立标准曲线,经过特异性、敏感性以及符合率验证,从而建立BVDV的Taq Man实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法于阳性标准质粒拷贝数为1×10～1×10拷贝/μL时线性关系良好,R=0.998;该方法最低检测限为10拷贝/μL;可以特异性检测BVDV,与牛冠状病毒(BCV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)以及牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)无交叉反应。同商品化试剂盒比较,符合率为97.5%。同时进行BVDV攻毒试验,建立BVDV攻毒模型。结果表明,攻毒组三头犊牛均出现体温升高,并超过40℃;且明显出现精神沉郁,眼分泌物增多,腹泻等BVDV临床症状,临床评分显著高于对照组。对采集的鼻拭子进行荧光定量PCR检测排毒情况,排毒分别于第5 d和6 d开始,持续7 d,且在第9 d和10 d达到排毒高峰,排毒量最高可达1380.38拷贝/μL。采集抗凝全血进行白细胞计数,结果表明攻毒组白细胞水平明显下降,白细胞下降率在25.3%～38.8%,平均下降率为30.5%。组织病理切片结果显示攻毒组回肠出现典型肠黏膜上皮细胞坏死脱落,充血,出血现象;肝脏和肺脏均出现炎性细胞浸润灶。综上所述,本研究建立的Taq Man实时荧光定量PCR检测方法为BVDV的早期快速诊断提供了技术支持,BVDV攻毒模型有利于后续的疫苗评价及致病机制研究。