第三代测序ONT鉴定左心室逆向重构的关键基因/异构体

作     者：张子豪 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱学海

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：心肌肥厚 心脏逆重构 ACOT7:脂肪链延长 

摘      要：目的:本项目通过动物模型模拟左室逆重构过程,通过三代测序阐明该模型中左室结构及功能复原的时间动力学,探讨了心肌重构和逆重构过程中的生物标记物及调控心肌逆重构的关键通路和分子。方法:本研究首先构建了小鼠心肌肥厚和左室逆重构模型,并采用第三代纳米孔的单分子实时电信号测序研究模型中的基因表达改变情况。基于三代测序的特点,分析比对三代测序数据的序列特点和基因可变剪切体表达水平。然后联合多个数据库中的人类和小鼠心肌肥厚数据集,共同筛选出新发现的心肌肥厚生物标记物和逆重构过程中的关键脂肪酸链延长通路。通过构建ACOT7过表和敲低慢病毒,感染大鼠乳鼠心肌原代细胞,通过Western blot、RT-PCR及免疫组织荧光等研究其对心肌细胞的影响,最后在PE刺激下的心肌细胞肥厚模型中敲低ACOT7,观察其对心肌肥厚的逆转作用。数据使用R(version 4.0.2)进行处理与计算,计量资料以x±s表示,进行独立样本t检验,认为当P0.7,***.p-value0.05时,基因为差异表达基因。结果:对比已知的参考基因组ONT的m RNA转录本长度数量显示转录本长度多集中于中间部分,参考基因组中的大量短转录本可能为中长链转录本截断后被错误识别为独立转录本。大量新可变剪切体也被测到,结果显示单个基因可存在多个可变剪切体,其中以外显子跳跃可变剪形式最为常见。同一个基因的多个不同剪切体的表达趋势相反,并共同调控平衡生物体的表型。筛选出在假手术组和松解术组中低表达,而在主动脉弓缩窄术中高表达的基因组群,将其称之为A型趋势基因组,或趋势与之相反的基因组群,将其称之为V型差异基因组群。在GEO数据库中筛选得到人类心肌肥厚测序数据集2个,小鼠心肌肥厚模型测序数据集3个,联合以上数据集,筛选出心肌肥厚生物标记物基因8个。通过对上述各基因组群以及在基因本体论、京都基因与基因组百科全书数据库中的进行富集,其结果高度集中于脂肪酸代谢方向,其中脂肪链延迟通路被多次富集到,该通路中ACOT7改变最为显著,ACOT7过表达在PE诱导的NCRMs心肌肥厚细胞模型中促进心肌细胞的肥大,而ACOT7敲低则可显著降低模型中心肌细胞的大小。结论:三代测序可更为精准的测量同一基因不同可变剪切体的表达情况,其中发现的ACOT7可通过干预脂肪酸链延长影响心肌细胞大小,进而调控心肌肥厚与心脏逆重构的发展进程。