水稻和梨铜转运因子HMA5的抗病功能分析

作     者：吴瑞瑞 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡新忠;王教瑜

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：HMA5 水稻白叶枯病 梨火疫病 铜 抗病性 

摘      要：由稻黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病是粮食作物水稻的重要病害。由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora,Ea)引起的火疫病是梨和苹果的毁灭性病害。两种病害均为重要的细菌维管束病害。目前国内对于这两种病害的主要应急防治措施是化学防治。铜制剂被广泛用于各种植物病害的防治,但因有些植物对铜敏感,其应用受到了限制。因此,如何降低铜制剂适用浓度从而扩大作物病害防控适用范围非常值得研究。重金属转运ATP酶(Heavy metal transporting ATPase,HMA)具有潜在的铜转运功能,但其抗病功能尚不明确。本研究阐述HMA5的铜转运功能以及铜对Xoo和Ea的抑菌和诱抗功能,分析在外施低浓度铜制剂条件下,利用HMA5将铜富集至病原菌侵入部位(维管束)杀死病菌Xoo和Ea的防控策略可行性。获得的主要结果如下:(1)阐明了水稻HMA5在水稻抗Xoo中的正调控作用及部分机制。创制了水稻Os HMA5超表达转基因株系和CRISPR/Cas9敲除突变体株系,明确了Os HMA5正调控水稻对Xoo的抗性。Os HMA5在植物不同生长期都主要在根部表达,起到将铜从根部通过木质部转运到地上部的作用。Os HMA5正调控植株地上部铜浓度、水稻叶片中flg22(Flagelin 22)激发的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)迸发和Xoo诱导的早期ROS迸发。1.6 m M Cu SO可完全抑制至少8个Xoo代表菌株的生长。0.1μM以上浓度Cu喷雾水稻叶片或水培强烈诱导ROS积累。利用免疫共沉淀偶联质谱分析技术(IP-MS)鉴定获得Os HMA5的潜在互作蛋白铜伴侣蛋白Os ATX1(Antioxidant Protein 1),该蛋白负责转运细胞内的铜离子。并利用分子荧光互补、酵母双杂和萤火素酶互补分析证明了Os HMA5与ATX1直接结合,并定位在细胞膜上。Xoo接种后24 h、Cu处理后5 h均强烈诱导Os HMA5表达。表明Os HMA5可能通过与Os ATX1互作,将铜转运富集至叶片,发挥激发ROS等抗性反应和杀菌双重功能,抑制Xoo扩展。此外,Os HMA4和Os HMA9能响应Xoo的晚期侵染,也与Os ATX1直接结合,表明这两个Os HMAs也参与水稻抗Xoo中,但作用时间点等可能与Os HMA5不同。(2)初步明确了梨HMA5的抗Ea功能。通过梨实生苗嫩枝的带菌牙签刺入接种分析明确了梨品种玉露香对Ea的抗性。通过玉露香和感病品种库尔勒香梨的蛋白组学分析鉴定获得差异表达蛋白192个,其中包括HMA5等30个抗病和防卫相关蛋白和13个氧化还原相关蛋白。鉴定明确了杜梨(Pyrus betulifolia)和白梨(Pyrus bretschneideri‘Dangshansuli’)均含9个HMA家族成员。通过分子荧光互补、酵母双杂和萤火素酶互补分析证明了Pbe HMA5、Pbe HMA6、Pbe HMA7和Pbe HMA9与Pbe ATX1直接结合。1.5 m M Cu SO强烈抑制Ea的生长。瞬时异源表达Pbe HMA5强烈抑制Ea激发本氏烟产生的过敏反应。表明Pbe HMA5可能类似Os HMA5,通过转运富集铜抑制梨火疫病菌的扩展。综上所述,本研究阐明了Os HMA5的抗Xoo功能,揭示了Os HMA5与Os ATX1互作,将铜转运富集至叶片,同时发挥激发抗性反应和杀菌双重功能,抑制Xoo扩展的作用机制。探明梨HMA5可能对火疫病菌起类似作用。所获结果丰富了对维管束细菌病害抗性机制的认识,提供通过创制和利用HMA5超表达抗病作物种质拓宽铜制剂适用作物病害范围、减少铜制剂使用从而降低铜污染的新思路。