OAS1蛋白通过促进血管内皮细胞功能紊乱影响动脉粥样硬化的机制研究

作     者：黎伟康 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄宪章

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：动脉粥样硬化 炎症 OAS1 血管内皮细胞 NF-κB 

摘      要：研究背景和目的: 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种慢性进行性血管病变,主要由脂质代谢紊乱和全身炎症反应引起,是导致全球心血管疾病发病率和死亡率增加的主要原因之一。在AS的发展过程中,血管内皮细胞(Vascular endothelial cell,VEC)扮演着极其关键的角色,它们通过分泌生理活性物质、调节血管张力等多种方式来维持血管正常的生理功能。然而,受到高血脂、高血糖、高血压、氧化应激和感染等因素的刺激,血管内皮细胞可能发生功能紊乱和炎症反应,这成为导致AS发生和发展的关键因素之一。因此,及早干预和控制血管内皮细胞的炎症反应和功能紊乱,将有助于预防和延缓AS的发生和发展,从而降低心血管疾病的发病率和死亡率。OAS1蛋白是一种由OAS1基因编码的酶,目前研究认为,它参与了抗病毒的先天免疫反应。当双链 RNA(Double strand RNA,dsRNA)刺激 OAS1 时,OAS1 合成 2 -5 寡腺苷酸(2 -5 -oligoadenylate,2-5A),随后,2-5A作为第二信使激活核酸内切酶L(RNase L),从而降解病毒RNA。同时,激活的RNase L还可以引起细胞转录组的改变、翻译的阻滞、功能障碍和凋亡。尽管OAS1在抗病毒免疫方面的作用已被深入研究,但其在调控血管内皮细胞炎症和功能方面的研究尚不明确,特别是在AS发生和发展中的意义和作用方面,值得进一步探讨。 课题组前期研究中发现,组织芯片发现OAS1的mRNA在人AS组织中高表达,免疫组化(Immuno histochemistry,IHC)表明OAS1在人AS组织处高表达,提示OAS1在AS中起着一定作用,但OAS1在AS中作用及其是否参与内皮细胞的炎症反应,及其相关机制仍需要进一步探索。本研究旨在探究OAS1在AS组织中的表达,并且使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导血管内皮细胞炎症模型,研究OAS1在调控血管内皮细胞炎症和功能紊乱方面的作用和机制。 方法: 第一部分OAS1蛋白在动脉粥样硬化组织中的表达 1.采用基因芯片技术鉴定人类AS组织中差异表达基因,使用ELISA法测定表观健康人、心绞痛、心肌梗死和心衰患者血清中的OAS1浓度,进一步收集了不同分期的AS组织样本,Masson染色明确斑块分期,通过IHC检测OAS1与P65蛋白表达水平。 2.小鼠AS组织进行油红O染色、Masson染色和HE染色,以验证成模效果;进一步使用IHC检测小鼠AS组织中OAS1蛋白的表达。 3.从GEO数据库中检索AS组织mRNA芯片数据,使用R软件(3.6.3版本)并结合limma包、umap包、ggplot2包、ComplexHeatmap包进行数据处理、分组和差异分析,观察OAS1的表达变化。 第二部分OAS1蛋白在血管内皮细胞功能紊乱中的作用 1.利用LPS浓度梯度、时间梯度,确定刺激浓度和时间;使用LPS刺激血管内皮细胞,建立炎症模型;利用RNAi技术敲减OAS1的表达,免疫印迹实验检测OAS1蛋白表达量,qPCR检测炎症因子ICAM1、VCAM1、IL-6、MCP1、TNFα水平 2.给予LPS刺激的同时敲减OAS1,单核细胞黏附实验测定OAS1对内皮细胞黏附单核细胞数量影响;特异性染料染色后流式细胞仪检测OAS1蛋白对血管内皮细胞ROS、NO含量的影响。 第三部分OAS1蛋白调控血管内皮细胞中NF-κB通路活性的作用机制研究 1.对敲减OAS1的血管内皮细胞同时给予LPS刺激,检测OAS1、NF-κB信号通路关键因子P65和P-P65蛋白的表达。 2.功能挽救实验:对血管内皮细胞敲减OAS1和P65并给予LPS刺激,采用单核细胞黏附实验测定OAS1和P65蛋白对内皮细胞黏附单核细胞数量影响;通过流式细胞术检测OAS1和P65蛋白对血管内皮细胞ROS、NO含量影响。 结果: 第一部分OAS1在AS组织呈高表达,且与AS严重程度有关 ***1的mRNA在人AS处呈高表达;与表观健康人相比,心绞痛、心梗和心衰病人血清中OAS1蛋白含量上升,且随AS病变程度增高;与Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分期的人AS组织相比,OAS1蛋白在Ⅳ期中表达明显升高,且与P65蛋白呈正相关。 ***模型小鼠主动脉斑块面积增大且胆固醇含量明显增高,主动脉胶原纤维沉积明显增多,OAS1蛋白在AS模型小鼠斑块处高表达。 ***数据库分析得出,相较正常组织,OAS1在AS组织中mRNA表达量上调1.8倍;相较早期斑块,OAS1的mRNA表达量在晚期斑块中明显增高。 第二部分OAS1参与调控血管内皮细胞功能紊乱 1.血管内皮细胞在LPS的刺激作用下,OAS1蛋白含量相较阴性对照组(Negative Co