R2R3-MYB转录因子调控酸枣仁黄酮醇合成的分子机制

作     者：刘钰 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李新岗

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：酸枣 酸枣仁 黄酮醇 MYB转录因子 调控 

摘      要：枣(Ziziphus jujuba Mill.)是鼠李科枣属植物,是我国传统特色经济林果。酸枣(Ziziphus jujuba var.spinosa Hu)是其变种和野生类型,多为灌木,主要分布我国北方,其种子,即酸枣仁可入药,富含黄酮醇类物质,是我国传统中药,具镇定安神功效。为了明确酸枣仁黄酮醇生物合成及调控的分子机制,本研究以两个酸枣类型(‘清涧酸枣’‘甜酸枣’)和一个枣品种(‘襄汾圆枣’)为材料,采用实时荧光定量、瞬时过表达和沉默、双荧光素酶试验、GUS活性检测等分子生物学手段,探究转录因子对酸枣仁黄酮醇合成的调控机制,以期为酸枣仁营养价值开发和利用提供理论依据。主要研究结果如下:(1)黄酮醇含量测试表明,在发育成熟过程中,‘清涧酸枣’‘甜酸枣’和‘襄汾圆枣’的种仁和果肉中均检测到了5类黄酮醇类物质,分别是槲皮素、槲皮素-3-芸香糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷和槲皮素-3-葡萄糖苷。黄酮醇含量在枣、酸枣的种仁和果肉发育中总体呈现下降趋势,且酸枣中黄酮醇含量显著高于枣。膨大期时果肉中黄酮醇类物质含量高于种仁,随着果实生长发育,初红期后种仁中黄酮醇物质含量总体高于果肉。(2)‘甜酸枣’种仁转录组筛选,获得4个候选转录因子(ZjMYB3a、ZjMYB3b、ZjMYB12和ZjMYB308)。氨基酸序列比对与进化树分析表明,ZjMYB3a、ZjMYB3b、ZjMYB12和ZjMYB308具有典型的R2和R3保守结构域,且与其他物种中调控黄酮醇生物合成的转录因子具有同源性。q RT-PCR和相关性分析表明,上述4个转录因子的表达模式与黄酮醇含量变化呈显著正相关。(3)枣果实瞬时过表达显示,ZjMYB3a、ZjMYB12和ZjMYB308可显著提高黄酮醇含量,而ZjMYB3b对黄酮醇积累没有促进作用;病毒诱导沉默试验表明,降低ZjMYB3a、ZjMYB12和ZjMYB308的表达水平可导致黄酮醇含量显著减少。基因表达量分析显示,ZjMYB3a、ZjMYB12和ZjMYB308对苯丙烷代谢途径上的Zj4CL基因具有激活作用,对黄酮醇合成通路上的ZjF3H、ZjF3’H和ZjFLS具有正向调控作用,ZjF3’5’H在过表达ZjMYB3a、ZjMYB12和ZjMYB308时显著降低。同时,ZjMYB3a、ZjMYB12和ZjMYB308对花青素合成通路的Zj ANS具有负调控作用,并正向调控Zj LAR。ZjMYB12和ZjMYB308正向调控Zj DFR,ZjMYB3a抑制Zj DFR的表达。在烟草瞬时过表达试验中检测到了一种黄酮醇类物质为槲皮素-3-芸香糖苷,瞬时过表达ZjMYB3a、ZjMYB12和ZjMYB308后同样显著增加黄酮醇含量。(4)双荧光素酶结果显示,ZjMYB3a、ZjMYB12和ZjMYB308可激活黄酮醇合成关键基因ZjFLS1和ZjFLS2的启动子活性。GUS报告基因检测结果与双荧光素酶试验结果一致。综上所述,黄酮醇含量在枣、酸枣的种仁和果肉发育中总体呈现下降趋势,且酸枣中含量显著高于枣中的含量,种仁中黄酮醇含量总体自初红期开始高于果肉;筛选鉴定了正向调控酸枣仁黄酮醇合成的R2R3-MYB转录因子ZjMYB3a、ZjMYB12和ZjMYB308,揭示了酸枣仁黄酮醇生物合成的分子调控机制,为酸枣仁黄酮醇等特异成分定向选种和利用提供了基础。