靶向CD44和EGFR的多价抗体募集复合物的合成及活性评价

作     者：郑乐乐 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周志昉

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100701[医学-药物化学] 10[医学] 

主      题：肿瘤靶向治疗 抗体募集 GE11 7D12 鼠李糖 

摘      要：恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康安全,目前常用的手术、化疗、放疗等治疗手段缺乏靶向特异性,容易对正常细胞造成一定的损伤。由靶向结合端和抗体结合端构成的抗体募集分子具有靶向肿瘤细胞和募集内源性抗体的双重功能,在肿瘤免疫治疗方面具有巨大的应用前景。内源性抗体是人体内天然存在的抗体,如抗鼠李糖(Rhamnose,Rha)抗体约占人体血清蛋白总量的2～8%。然而,单价抗体结合端募集内源性抗体的能力有限,并且肿瘤细胞往往缺乏特异性靶点,容易造成靶向结合端的脱靶问题,影响抗体募集分子的作用效果。由于多价抗体结合端是进一步提高抗体募集能力的重要方向,双重靶向结合端是解决脱靶问题的有效策略,因此可以通过构建双靶多价抗体募集分子来提升其作用效果。鉴于此,本论文以环糊精修饰的透明质酸作为肿瘤标志物CD44的靶向配体,将其与抗体募集配体Rha偶联。同时以金刚烷修饰的多肽GE11或纳米抗体7D12作为表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向配体,通过环糊精和金刚烷的主客体相互作用将其偶联至透明质酸骨架,形成两种具有双靶特性的多价抗体募集复合物。首先通过细胞免疫荧光、流式细胞术等实验对复合物的双靶特异性和抗体募集能力进行表征。其次,通过补体依赖的细胞毒作用(Complement-dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(Antibody-dependent cellular phagocytosis,ADCP)对复合物介导的抗肿瘤活性进行评估。主要研究内容和结果如下:(1)多价抗体募集复合物主体分子的构建。通过化学法制备了氨基修饰的环糊精β-CD-EDA以及氨基修饰的Rha衍生物Rha-PEG-NH,产率分别为33.13%和55.29%。通过酰胺缩合反应将环糊精和Rha衍生物偶联至透明质酸骨架得到主体分子Rha-HACD,取代度分别为17.25%和38.96%。(2)多价抗体募集复合物客体分子的构建。通过eSrtA酶介导的连接反应,将金刚烷修饰至纳米抗体7D12的C端得到客体分子Ada-7D12,产率为70.03%。通过固相多肽合成法制备另一种客体分子,即金刚烷修饰的多肽Ada-GE11,产率为57.85%。(3)多价抗体募集复合物的制备。通过环糊精和金刚烷的主客体相互作用,将主体分子和客体分子进行连接,形成两种多价抗体募集复合物。(4)多价抗体募集复合物Rha-HACD/Ada-GE11的活性验证。通过流式细胞术和免疫荧光等实验证明复合物能够特异性地识别表达CD44和EGFR的肿瘤细胞并将抗Rha抗体募集至细胞表面。肿瘤细胞杀伤实验表明,复合物可以通过招募抗Rha抗体发挥CDC和ADCP活性杀伤肿瘤细胞,CDC和ADCP活性分别为56.87%和42.75%。(5)多价抗体募集复合物Rha-HACD/Ada-7D12的活性验证。细胞免疫荧光和流式细胞术等实验分析表明,复合物可以特异性识别肿瘤细胞并招募抗Rha抗体。通过免疫杀伤实验表明,复合物能够介导一定程度的CDC和ADCP效应,细胞杀伤率和细胞吞噬率分别为58.71%和45.41%。