转甲状腺素蛋白功能界面的优化研究

作     者：田一焜 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：辛瑜;姚譞

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：转甲状腺素 糖尿病视网膜病变 新生血管生成 核内不均一核糖核蛋白 

摘      要：糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)严峻的危害了糖尿病患者的视力及身心健康。此种慢性糖尿病并发症是患者异于常人的眼部微环境所导致,由于人视网膜内皮细胞(Human Retinal Endothelial Cells,HRECs)和周围毛细血管较为脆弱,其长期暴露于高血糖的环境进而发生相关的病变。根据我们的前期工作基础说明转甲状腺素蛋白(Transthyretin,TTR)与核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hn RNP)A2B1之间的相互作用调控了高血糖条件下人类视网膜微血管内皮细胞的新生血管形成,对DR有一定阻遏效果。然而,TTR-hn RNPA2B1界面是否可以改变,以及TTR的改造如何改变蛋白质相互作用和相关的下游通路是否受到调节还尚不清楚。本文从蛋白对接界面出发,通过改造TTR来阐述这一机制。本研究通过筛选与人源TTR序列一致性25-99%的100条序列进行祖先序列重建分析并使用Discovery Studio进行突变自由能计算设计并成功表达19种TTR突变体。与原始TTR一起进行分子与细胞实验分析其对DR进程的影响。证实了TTR-hn RNPA2B关键作用界面在高糖条件下对调节DR有着巨大潜力。结果表明:(1)在TTR或突变体和hn RNPA2B1二者的结合方面:通过圆二色谱图结果表明,19种突变体与原始TTR的二级结构整体上并未发生明显变化,免疫荧光实验说明TTR与突变体TTR均可以快速进入细胞核为后续实验奠定基础。免疫共沉淀实验揭示了TTR与hn RNPA2B1可以互相捕捉,在关键作用界面上自由能的改变与二者的相互作用有着密切的联系。自由能的降低可以加强二者的结合,相反较高的自由能可以降低二者的结合能力甚至在破坏二者的结合。(2)在影响DR进程方面:qRT-PCR和Western-blot结果显示,高糖环境下原始TTR的介入可以显著低表达STAT-4、mi R-223-3p提高FBXW7的表达,相比之下不同的突变体蛋白对这一进程的影响有着相近或相反的效果。细胞行为学实验说明,高糖环境可显著促进DNA合成、迁移、增殖、划痕愈合和体外管形成,设计低糖和渗透压组作为对照组,原始TTR和部分突变体的添加显著挽救了这些现象。(3)在界面功能方面:界面片段1,34-39:-RKAADD-,不仅在氨基酸序列方面而且在功能方面也相对保守,尽管自由能的降低和升高可以稳定或破坏TTR-hn RNPA2B1复合物,但在蛋白和RNA表达水平与细胞功能上,这个片段的取代均降低了原始TTR对DR进程的抑制。在界面片段2和3(61-68:-EEEFVEGI-:96-102:-TANDSGP-)中68I和99D对界面功能有重要的调节作用。以高糖组和添加原始TTR的高糖组作对照,不同氨基酸的取代对DR进程的影响,在细胞功能和蛋白与RNA表达上,不管是加强抑制能力还是提高促进效果均有出现。