内源酶在芝麻浸泡加工中的应用研究
作者单位：江南大学
学位级别：硕士
导师姓名：陈业明;宋伟光
授予年度：2023年
学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学]
摘 要：食用醋泡花生、大豆是我国传统的食疗方法,这类食物对人体具有多种益处。植物生理学研究表明,种子萌发时,细胞内的蛋白质贮藏液泡会被酸化,其内的酸性蛋白酶等内源酶活性增强,进而水解贮藏蛋白等为种子发育提供营养和能量。本实验室前期对花生、大豆和芝麻等植物种子的内源性蛋白酶进行了研究,已证实芝麻内源性蛋白酶活性最高。因此,本文以种子萌发时蛋白质贮藏液泡会被酸化这一植物生理现象为科学依据,以醋泡花生、大豆为实践原型,基于醋酸溶液的成分特点和良好的抑菌作用,选择醋酸溶液浸泡脱皮芝麻作为研究体系,探讨浸泡过程中各类成分变化和细胞生理活动,以此创制一种新型的芝麻基食品;并基于内源酶的特点,对芝麻蛋白和脂质的综合加工利用进行初步尝试。具体研究内容和结果如下:首先,建立脱皮芝麻的浸泡体系模型,即料液比为1:3的浸泡体系。考察了醋酸浓度(0.0%～2.5%)、浸泡温度(25℃～60℃)和浸泡时间(12 h、1～7 d)对芝麻蛋白降解和释放(即芝麻中的蛋白质降解及释放进入浸泡液)的影响,并综合考虑浸泡体系的稳定性和风味,选择浸泡条件为:2.0%醋酸溶液、25℃浸泡7天,此条件下,脱皮芝麻中约60%的蛋白成分释放进入浸泡液,并且浸泡液中蛋白成分的三氯乙酸-氮溶指数(TCA-NSI)高达89%,表明了醋酸浸泡的可行性和有效性。其次,对浸泡体系进行优化,即减少用液量,以醋酸溶液能没过脱皮芝麻为判断标准,此时料液比为1:1.5,在25℃下利用1.0%～3.0%醋酸溶液浸泡脱皮芝麻7天。结果表明,2.0%醋酸溶液浸泡可使最多的蛋白成分释放进入浸泡液,并且浸泡液中的蛋白成分的TCA-NSI最大;在2.0%醋酸溶液浸泡过程中,脱皮芝麻在浸泡的第1天内即被酸化至p H 4.5,之后基本维持在p H 4.5左右,与芝麻内源性蛋白酶最适p H 4.5完全一致;在浸泡7天后,蛋白成分的释放率为37%,TCA-NSI高达91%,而保留在芝麻中的蛋白成分的TCA-NSI为57%。2.0%醋酸溶液浸泡热变性的脱皮芝麻实验进一步确认,浸泡过程中蛋白质的降解与释放是由内源性蛋白酶导致的。然后,对浸泡体系(料液比为1:1.5,在25℃下利用2.0%醋酸溶液浸泡脱皮芝麻7天)中的主要成分和相关酶类进行系统分析。Tricine-SDS-PAGE和非酶切LC-MS/MS结果显示,油体膜蛋白全部被降解,11S球蛋白发生极大程度的降解,而2S清蛋白对内源性蛋白酶具有显著的抗性;TCA-NSI、氨基酸和SEC-HPLC分析结果显示,在整个浸泡体系(即浸泡液+浸泡芝麻)中,蛋白成分由31%的游离氨基酸、39%的TCA可溶性小分子量肽以及30%的大分子量肽和蛋白质组成,说明芝麻蛋白发生了极大程度的水解。对芝麻内源性脂肪酶和脂质成分变化的研究结果显示,脂肪酶的最适p H为4～5,主要包括14种GDSL酯酶/脂肪酶;在上述条件下浸泡后,芝麻油中的游离脂肪酸由0.10%大幅增加至28.74%。对芝麻内源性植酸降解酶和植酸含量变化的研究结果显示,植酸降解酶也可在p H 4.5下降解植酸,经上述条件浸泡后,植酸的降解率可达60%。接着,考察了浸泡过程中芝麻种子细胞中蛋白质贮藏液泡和油体结构的变化规律,并对浸泡体系进行蛋白质组学和代谢组学研究。透射电子显微镜结果显示,浸泡1天后,各个蛋白质贮藏液泡都发生破碎,形成多个蛋白质颗粒,少量油体发生聚结,此时,细胞内部还能保持一定的有序结构;浸泡2天后,细胞内部的有序结构被彻底打破;浸泡7天后,细胞内仅剩少量蛋白质颗粒和一个不规则油相,细胞壁上还出现一些明显的“伤口。蛋白质组学结果显示,与胁迫等相关的蛋白质呈现表达上调,而与细胞正常生理活动等相关的蛋白质呈现表达下调。因此,按照植物生理学理论可将浸泡过程分为两个阶段:1)酸和低氧胁迫状态下的细胞应激阶段,2)无序的生化反应阶段——细胞死亡阶段,两个阶段是以内源性蛋白酶导致的蛋白质贮藏液泡破碎为界限。代谢组学结果显示,亚精胺、苯乙胺、精胺、白藜芦醇等功能性代谢产物大幅增加,而尿素和三乙醇胺等有害代谢产物显著降低,表明与这些代谢产物合成和降解相关的内源酶也发挥了作用,这与中药炮制中醋制的“减毒增效说法相契合。最后,基于芝麻油加工的基本思路和内源性蛋白酶的活性,设计了一种芝麻加工新工艺:先将脱皮芝麻低温干燥、冷榨得到芝麻油,再利用保留在冷榨芝麻中的高活性内源性蛋白酶,经过醋酸浸泡实现对蛋白质的高效降解,从而实现芝麻蛋白和脂质的综合利用。在该工艺中,芝麻蛋白可达到53%的释放率,释放的蛋白成分的TCANSI约为80%。对于脱皮芝麻的醋酸浸泡体系,其实际可作为一种预消化功能食品:内源酶预水解蛋白质和甘油三酯,合成一些功能性代谢产物,降解植酸和一些有害代谢产物,因此,推荐“连吃带喝作为这种食品的食用方式。对于先冷榨再醋酸浸泡工艺
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