真菌感染患者近平滑念珠菌分离情况及其生长代谢相关功能基因的筛选及初步验证

作     者：王顺 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗振华

授予年度：2022年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：念珠菌感染 药物敏感特征 近平滑念珠菌 转录组学 功能基因 

摘      要：目的:研究贵州地区深部念珠菌感染以及近平滑念珠菌感染的临床特点,并基于前期转录学测序信息筛选验证与近平滑念珠菌生长代谢相关功能基因,为近平滑念珠菌感染防治以及抗真菌药物研发奠定基础。方法:1.通过沙氏葡萄糖琼脂培养基分离培养菌种,采用革兰氏染色法、科玛嘉显色培养基观察菌种形态,BACTEC?FX仪、Phoenix-100仪对菌种进行鉴定;通过对菌株ITS序列和D1/D2序列测序进行更准确的种类鉴定;筛选部分血源性的近平滑念珠菌临床菌株,检测其生物膜形成能力。2.采用ATB FUNGUS 3药敏试剂盒对念珠菌的体外药物敏感情况进行测试。3.利用GO、KEGG富集分析对抗菌肽MAF-1A作用近平滑念珠菌的转录组测序结果进行分析,筛选出近平滑念珠菌生长代谢关键功能基因,通过q RT-PCR技术对转录组测序结果进行初步的验证;利用q RT-PCR技术检测不同生物膜形成能力菌株的COX15和CDC28基因的表达水平。结果:1.共分离的1917株念珠菌感染菌株中,白色念珠菌占据首位(49.2%),其次为光滑念珠菌(19.0%)、热带念珠菌(15.8%)、近平滑念珠菌(8.5%)、克柔念珠菌(4.5%);主要引起血源性念珠菌感染的为近平滑念珠菌(37.6%),白色念珠菌(27.8%)和光滑念珠菌(18.8%)。2.药敏结果显示大多数念珠菌对5-氟胞嘧啶和两性霉素B强敏感;对于唑类药物,除近平滑念珠菌无明显耐药性外,其他几类念珠菌均有显著耐药性,且存在交叉耐药,其中白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌对伊曲康唑显示较高的耐药性,耐药率分别为6.9%、15.9%和18.0%,克柔念珠菌对氟康唑耐药性最高,达15.7%。3.贵州地区近平滑念珠菌复合群包括近平滑念珠菌Ⅰ型(73.0%)、Ⅱ型(6.1%)和Ⅲ型(20.9%)。不同基因型菌株对常见抗真菌药物无显著耐药性。4.在13株近平滑念珠菌临床菌株中,92.3%的菌株具有生物膜形成能力,分别有2株(15.4%)、4株(30.8%)和7株(53.8%)菌株生物膜形成能力强、一般、弱。5.转录组测序分析发现MAF-1A作用近平滑念珠菌6小时有2187个基因表达有差异,通过GO、KEGG富集分析发现差异表达基因在氧化还原过程和次生代谢物的生物合成代谢通路富集最显著,进一步筛选出分别与这两个过程中的线粒体呼吸功能及细胞周期相关的功能基因COX15和CDC28,q RT-PCR验证上述基因与转录组测序结果一致,具有可行性;通过q RT-PCR检测COX15和CDC28在生物膜形成能力不同的菌株中的表达,发现COX15和CDC28在生物膜形成能力强以及能力一般的菌株中表达上调。结论:1.贵州地区白色念珠菌是引起深部念珠菌感染的主要菌种,但其他非白色念珠菌呈逐年上升的趋势,尤其以光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌为常见感染菌;血源性感染主要以近平滑念珠菌、白色念珠菌和光滑念珠菌为主。分离的念珠菌对5-氟胞嘧啶和两性霉素B呈现较强敏感性,对唑类药物呈现较强耐药性及交叉耐药性。2.分离的近平滑念珠菌复合群以Ⅰ型感染为主,三种基因型菌株对抗真菌药物无明显耐药性。***-1A对近平滑念珠菌的干预作用可能主要是影响其线粒体呼吸功能及细胞周期等过程,COX15、CDC28可能参与了这两个过程中细胞色素c的生成和细胞周期的调控以至影响近平滑念珠菌活性氧的产生和细胞周期的稳定性,并且发现这两个基因可能对近平滑念珠菌生物膜的形成有一定的影响。