家蚕N-聚糖生物合成通路基因MAN1B和MAN2在滞育调控中的作用研究

作     者：阿依努尔·亚森 

作者单位：江苏科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈兴家;朱娟

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：家蚕 滞育 N-聚糖 内质网α-1,2甘露糖苷酶 α-甘露糖苷酶Ⅱ 

摘      要：家蚕(Bombyxmori)是世界上最重要的经济昆虫,也是重要的鳞翅目模式生物。家蚕滞育是基因与环境协同作用的结果,其调控网络十分复杂,至今仍未完全阐明。为了解家蚕N-聚糖生物合成通路是否参与胚胎滞育调控,以家蚕一化性品系安康4号(AK4)、二化性品系秋丰(QF)和P50、多化性有滞育品系四海(SH)、多化性无滞育品系Nistari为研究对象,采用RT-q PCR技术,分析内质网α-1,2甘露糖苷酶(BmMAN1B)和α-甘露糖苷酶Ⅱ(BmMAN2)基因在不同化性品系、二化性品系QF25℃明催青(QFHT)组和16.5℃暗催青(QFLT)组中的表达特性;然后在Bm N细胞中分析BmMAN1B和BmMAN2对外源滞育激素(DH)和蜕皮激素(20E)的响应;再进一步采用RNA干扰(RNAi)敲减和重组Bm NPV病毒过表达等技术,分析它们在二化性品系滞育调控中的作用,取得以下主要结果。***1B和BmMAN2基因的克隆及生物信息学分析以P50和秋丰雌蛹3d卵巢c DNA为模板,克隆BmMAN1B和BmMAN2基因的CDS序列,其基因大小分别为1740 bp和3486 bp。BmMAN1B和BmMAN2的CDS序列在P50、QF完全一致;而BmMAN2跟NCBI上预测的CDS序列同源性高达98.36%,有5个氨基酸的不同,差异位点不在功能域,不影响蛋白功能。生物信息学分析显示,BmMAN1B和BmMAN2都为酸性、亲水性蛋白质,BmMAN1B的稳定性较差,BmMAN2为稳定蛋白质,两者都存在一段跨膜结构域;MAN1B属于GH47家族;BmMAN2属于GH38家族。BmMAN1B和BmMAN2的功能域在不同物种间相对保守。***1B和BmMAN2在不同化性品系蛹期和胚胎发育早期的表达特性分析分别提取AK4、QF、SH和Nistari蛹期1-6d头部、卵巢和产卵后2-72h蚕卵的总RNA,采用RT-q PCR技术分析BmMAN1B和BmMAN2基因的表达水平。结果显示,BmMAN1B和BmMAN2基因在不同化性品系中的表达水平存在较大差异,蛹晚期的表达水平高于早期;在胚胎发育早期,品系Nistari中的表达水平高于品系SH,QFLT组中的表达水平高于QFHT组。提示BmMAN1B和BmMAN2与家蚕化性及滞育的发生存在关联。***1B和BmMAN2在Bm N细胞中对外源DH和20E的响应为进一步了解BmMAN1B和BmMAN2与滞育之间的相互作用,用不同浓度滞育激素(DH)和20-羟基蜕皮酮(20E)处理Bm N细胞,利用RT-q PCR技术检测BmMAN1B和BmMAN2的表达水平。结果显示,用浓度为100n M和10ng/m L的DH和20E分别处理Bm N细胞,BmMAN1B和BmMAN2基因的表达水平都极显著上调,提示BmMAN1B和BmMAN2与家蚕滞育密切相关。***和过表达BmMAN1B和BmMAN2对家蚕滞育的影响为进一步探究BmMAN1B和BmMAN2在家蚕滞育调控中的作用,在Bm N细胞和秋丰QFLT组蛹期2 d雌蛹分别进行了MAN1B和MAN2基因的RNAi和过表达试验。结果发现,不论是在Bm N细胞还是QFLT组2 d雌蛹MAN1B和MAN2基因的干扰,均检测到DH、DHR-1、TRE2和SDH-2a等滞育相关基因的表达水平发生变化,两个基因的变化趋势一致;过表达BmMAN1B和BmMAN2基因,均检测到DH基因表达水平下调,SDH-2a基因表达水平上调。后者可促使山梨醇转化成糖原,为胚胎发育提供能量,促进非滞育卵的发育。BmMAN1B和BmMAN2单基因的RNAi和过表达不改变滞育性状,而双基因干扰使蚕卵孵化延迟且38.2%的蚕卵由非滞育转变为滞育,证明BmMAN1B和BmMAN2协同参与家蚕二化性品系胚胎滞育的调控。综上所述,N-聚糖生物合成通路基因BmMAN1B和BmMAN2在不同化性品系、二化性品系滞育卵和非滞育卵中的表达水平存在较大差异,秋丰产非滞育卵组(QFLT)蛹期2 d雌蛹BmMAN1B和BmMAN2基因的共同干扰导致部分子代卵由非滞育转变为滞育,表明BmMAN1B和BmMAN2参与家蚕二化性品系胚胎滞育的调控。