青蒿素羟基氯喹复方治疗肺纤维化的作用及机制研究

作     者：王兆佳 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓长生

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：肺纤维化 青蒿素羟基氯喹复方 青蒿素 羟基氯喹 TGF-β1/Smad2/3信号通路 

摘      要：目的:通过体内实验,探索青蒿素羟基氯喹复方（Artemisinin-Hydroxychloroquine,AH）治疗博来霉素诱导的SD大鼠肺纤维化的作用及机制,以期为研发治疗肺纤维化新药提供新的思路。方法:1.动物模型复制:盐酸博来霉素（Bleomycin,BLM）溶液使用生理盐水配制,终浓度为4.5mg·mL,避光保存备用。深度麻醉SD大鼠,颈前备皮,沿大鼠颈部前正中线作一1cm纵切口,暴露气管,使用1mL注射器于环状软骨下穿刺气管并缓慢滴注博来霉素溶液(4.5mg·kg),复制肺纤维化大鼠动物模型。2.分组与给药:80只SPF级雄性SD大鼠,随机预分组为8组,每组10只,除假手术组外,其余70只大鼠用于制备肺纤维化动物模型。予造模药1周后,剔除死亡及体重过低大鼠,随机数法正式分组:假手术组（SHAM）、模型组（BLM）、AH低剂量组(AH-L,38.2 mg·kg·d)、AH中剂量组(AH-M,76.4mg·kg·d)、AH高剂量组(AH-H,152.8 mg·kg·d)、青蒿素组(ART,33.3mg·kg·d)、硫酸羟基氯喹组(HCQ,43.1 mg·kg·d)、阳性对照组(Prednisolone,PDN,3 mg·kg·d),每组8只。随机分组后每日灌胃给药,SHAM组及BLM组予等体积生理盐水,持续21天。***治疗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型的作用研究:每周称量各组大鼠体质量、观察一般状态变化并进行外观行为评分;实验终点时测量各组大鼠肺功能;计算肺指数、肝指数、肾指数;化验血常规、血生化;制备肺组织病理切片,HE染色病理片用于评估肺泡炎（Szapiel法）;Masson染色病理片用于评估纤维化情况（Ashcroft法）,综合上述指标,验证AH治疗肺纤维化的有效性及安全性。***治疗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的作用机制研究:Elisa法检测血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、血管内皮生长因子（VEGF）、E-钙黏蛋白（E-Cad）、羟脯氨酸（Hyp）、涎液化糖链抗原（KL-6）含量;Western Blot和q PCR检测肺组织中TGF-β1/Smad2/3信号通路中上下游分子(转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad2/3、P-Smad2/3、α-肌动蛋白（α-SMA）蛋白及相应mRNA表达水平,初步探索AH治疗肺纤维化可能的作用机制。结果:1.与SHAM组相比,BLM组大鼠在造模后1周内出现体质量下降及外观行为评分升高,2周起逐步恢复;肺功能提示肺动态顺应性、反应顺应性、深吸气量、潮气量、最高呼气流速下降（P0.05）;血常规中白细胞稍有升高,血生化中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素水平均未见明显异常（P0.05）。肺组织病理学检查提示大面积肺泡融合及纤维化样改变,其肺泡炎Szapiel评分及肺纤维化Ashcroft评分显著升高（P0.05）;肺指数稍有降低,且肺指数的下降程度与AH剂量呈正相关（P0.05）,肝肾指数未见显著改变（P0.05）;血常规提示,AH可降低白细胞水平,血生化中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素的改变不具备临床意义;肺组织病理学检查显示,AH以剂量依赖的方式降低了模型大鼠肺组织纤维化水平,AH高剂量组的肺组织可见更多完整肺泡结构,该组肺泡炎Szapiel评分明显降低（P0.05）。各项研究结果综合提示,AH高剂量组可通过抑制博来霉素诱发的肺部特异性炎症及细胞外基质沉积,安全有效地延缓PF动物模型的疾病进程。2.与SHAM组相比,BLM组血清中TNF-α、IL-6、KL-6、VEGF、Hyp均有不同程度升高,E-Cad较SHAM组稍有降低,其中VEGF的升高程度具有显著统计学差异（P0.01）;Western Blot显示其肺组织中TGF-β1、Smad2/3、P-Smad2/3的表达均增加,q-PCR结果同样提示Smad3 mRNA表达增加,证明本模型的发病机制涉及TGF-β1/Smad2/3信号通路。与BLM组相比,AH以剂量依赖的方式调节血清中多种细胞因子水平:TNF-α、IL-6、KL-6、VEGF、Hyp含量均