蚕砂中产1-脱氧野尻霉素菌株PD04的筛选、鉴定及特性研究

作     者：牛葆鑫 

作者单位：江苏科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：桂仲争

授予年度：2023年

学科分类：090504[农学-特种经济动物饲养（含：蚕、蜂等）] 0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：蚕砂 霍氏肠杆菌 DNJ 桑树提取物 糖酵解途径 基因表达 

摘      要：1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是一种哌啶类生物碱,具有抑制α-葡萄糖苷酶活性,研究表明,DNJ具有抗病毒、降血糖、抗肿瘤等应用效果。由于已知天然生物来源中1-脱氧野尻霉素含量过低,提取工艺较复杂,很难满足规模化生产的需要,结合微生物发酵工程技术,开展规模化DNJ应用生产成为本领域的重要研究方向。研究表明,桑树是天然DNJ的主要来源,家蚕通过食用桑叶而富集DNJ,排出的蚕砂中也含有一定量的DNJ。前期研究表明,自然发酵后蚕砂中DNJ含量高于未发酵蚕砂,推测发酵体系中微生物发挥了重要作用。本研究拟从蚕砂中筛选产DNJ菌株,鉴定其形态学特征、生物学特性及分子生物学特性等;研究桑提取物诱导该菌株提高DNJ产量的工艺条件;研究糖酵解抑制剂促进菌株中DNJ产量的工艺条件;研究糖酵解抑制剂影响该微生物中DNJ合成相关基因的表达,研究结果为开发微生物产DNJ及其应用提供技术基础,具体研究结果如下:1.蚕砂中产DNJ菌株的筛选、鉴定及生物学特性研究微生物培养法从蚕砂中筛选出一株产DNJ菌株PD04,通过形态学和分子生物学鉴定为霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)。该菌株为嗜酸性菌,有一定的盐耐受度,最适生长温度为40℃,培养12 h,菌株达到最快生长期。该菌株的最适生长条件为:培养温度40℃,p H 6.0,接种量4%和低于3%的盐含量。2.桑提取物诱导PD04菌株DNJ产量的工艺条件研究在PD04菌株发酵初始期添加桑叶生物碱醇提取物、桑籽生物碱醇提取物和桑叶黄酮类醇提取物,对菌液中DNJ的产量均有显著促进作用。当桑叶生物碱醇提取物添加量为0.30 mg/m L时,其DNJ含量达最高值为17.61μg/m L;桑籽生物碱醇提取物添加量0.20 mg/m L时,其DNJ含量达最高值为20.28μg/m L,桑叶黄酮类醇提取物添加量0.80 mg/m L时,其DNJ含量达最高值为26.37μg/m L,分别是各相应对照组DNJ产量的6.31、7.27和9.45倍。结果表明,桑叶黄酮类醇提取物提高PD04菌株发酵产DNJ的效果最佳。3.糖酵解抑制剂诱导PD04菌株DNJ产量的工艺条件研究在PD04菌株发酵初始期分别添加草酰乙酸、碘乙酸和柠檬酸钠,研究菌液中DNJ产量的变化。当草酰乙酸添加量为10 mmol/L时,其DNJ含量达最高值为6.06μg/m L;碘乙酸添加量3 mmol/L时,其DNJ含量达最高值为6.53μg/m L,柠檬酸钠添加量20mmol/L时,其DNJ含量达最高值为9.37μg/m L,分别是各相应对照组DNJ产量的2.17、2.34和3.35倍。结果表明,草酰乙酸、碘乙酸和柠檬酸钠都能显著提高菌液中DNJ含量,以柠檬酸钠提高PD04菌株发酵产DNJ的效果最佳。4.糖酵解抑制剂对PD04菌株中DNJ合成相关基因表达的影响以PD04菌株中的DNJ合成相关基因ytkc1和糖酵解途径调控基因fruk、pgi、gapa1为研究对象,研究不同糖酵解抑制剂对相关基因表达的影响,研究发现三种抑制剂影响各基因表达均符合预测趋势:10 mmol/L草酰乙酸发酵培养10 h,菌株DNJ合成基因yktc1基因和糖酵解途径调控基因fruk、pgi表达均下调,相对表达量分别是对照组的0.04、0.21、0.21倍;3 mmol/L碘乙酸发酵培养12 h,菌株yktc1、fruk、pgi、gapa1基因表达均下调,相对表达量分别是对照组的0.26、0.01、0.01、0.03倍;20mmol/L柠檬酸钠发酵培养12 h,菌株yktc1基因表达上调,相对表达量是对照组的2.06倍,fruk,pgi基因表达量下调,相对表达量是对照组的0.20,0.23倍。结果表明,草酰乙酸、碘乙酸和柠檬酸钠都能通过影响PD04菌株中DNJ合成相关基因及糖酵解调控基因的表达从而影响菌株合成DNJ,其中柠檬酸钠上调菌株中yktc1基因表达,使PD04菌株于12 h时DNJ产量达到最高的同时仍具有继续快速增长的能力,效果最佳。