DDX10调控AIM2炎症小体以及NLPR7调控Ⅰ型干扰素通路的机制研究

作     者：赵山美子 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张玉霞

授予年度：2020年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：天然免疫 NOD样受体 NLRP7 Ⅰ型干扰素 DDX10 AIM2 炎症小体 

摘      要：研究背景天然免疫作为机体免疫系统抵御外来入侵的第一道屏障,通过模式识别受体(PRRs)识别感染和感知细胞稳态的变化,以启动清除病原体的免疫反应或者机体的组织损伤修复,在此过程中会活化多条下游信号通路,包括Ⅰ型干扰素通路和促炎因子的释放。黑色素瘤缺失基因2(AIM2)是胞质中的ds DNA识别受体,可以识别来自病原体和宿主的ds DNA。结合DNA后,AIM2激活下游的炎症小体信号通路,与含有CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和胱天蛋白酶1(caspase-1)分子组装形成炎症小体复合体,最终诱导炎性因子IL-1β和IL-18的成熟和释放。AIM2炎症小体的不当激活或者慢性激活会引起阿尔茨海默病、血管炎症、银屑病等多种疾病,所以炎症小体信号通路的调控研究至关重要。DDX家族成员参与RNA代谢的几乎所有过程,在翻译起始、核糖体形成、前m RNA拼接和m RNA降解过程中发挥作用。近年来,DDX家族成员参与调控天然免疫应答成为免疫领域中的一个研究热点。然而,目前关于DDX家族成员蛋白是否在AIM2炎症小体通路中发挥功能还缺乏相关报道。Ⅰ型干扰素是机体在抵御病毒感染的早期所产生的关键性细胞因子,介导天然和适应性免疫的后续反应,在维持免疫稳态的过程中发挥重要作用。Ⅰ型干扰素信号通路激活功能的不足,容易引起慢性炎症、抗病毒免疫功能缺陷,而过度激活则会导致自身免疫性疾病。因此,Ⅰ型干扰素通路需要受到紧密调控,研究其调控机制显得尤为重要。NOD样受体(NLRs)作为胞内识别受体的一大家族,其成员不仅拥有PRRs的识别配体形成炎症小体的功能,部分成员还直接参与了信号通路的转导和调控。其中,NLRP7的生物学基础研究主要集中在NLRP7识别病原体形成炎症小体这一方面,临床疾病研究主要是与NLRP7点突变相关生殖系统疾病疾病表型病例报道。然而,对于NLRP7在天然抗病毒免疫中的作用,尤其是对抗病毒通路中核心分子的具体调控机制还没有任何报道。研究目的1、筛选DEAD盒解旋酶(DDX)家族成员对黑素瘤缺失基因2(AIM2)炎症小体通路发挥调控作用的分子,并研究DDX10对AIM2炎症小体通路的调控机制。2、探索NLRP7是否可以在Ⅰ型干扰素通路中发挥调控功能并明确NLRP7调控Ⅰ型干扰素通路的具体机制。方法通过在HEK293T-caspase-1-ASC-IL-1β(HEK293T-CIA)细胞系中过表达DDX家族成员和AIM2表达质粒,检测上清中的白细胞介素1β(IL-1β)的释放,筛选对AIM2炎性体通路有调控作用的分子。在DDX10缺失的THP-1细胞系,利用佛波酯(PMA)诱导下分化为巨噬细胞,用脂多糖(LPS)预处理,再用poly(d A:d T)刺激巨噬细胞激活AIM2炎性体。采用ELISA检测白细胞介素1β(IL-1β)的释放,Western blot法检测胱天蛋白酶1(caspase-1)蛋白的切割和DDX10蛋白水平。采用免疫共沉淀法检测DDX10和AIM2的相互作用,利用免疫荧光细胞化学染色法结合共聚焦显微镜技术确定DDX10和AIM2在HEK293T细胞的共定位情况。通过构建多西环素诱导表达的Flag标签的NLRP7的293T细胞系和si RNA特异性敲低内源NLPR7的表达,分别在过表达和敲低系统中探索NLRP7的功能。用仙台病毒(Sedai Virus,Se V)、poly(I:C)刺激细胞激活RLRs介导的Ⅰ型干扰素通路。利用荧光实时定量PCR检测干扰素β(IFNB)和干扰素诱导诱导基因(ISGs)的m RNA水平的变化。采用ELISA检测IFN-β的释放,Western blot法检测IRF3的总蛋白水平和磷酸化水平。采用免疫共沉淀法检测NLRP7与MAVS的相互作用。借助免疫荧光细胞化学染色法结合共聚焦显微镜技术确定NLRP7、MAVS在He La细胞的定位情况。结果1、过表达DDX10显著促进AIM炎症小体通路的激活。2、敲除DDX10显著抑制AIM2炎症小体通路的激活。3、DDX10与AIM2的HIN-200结构域存在相互作用。4、DDX10增强AIM2的蛋白稳定性。5、过表达NLRP7促进RIG-I样受体介导的Ⅰ型干扰素通路的激活。6、敲低NLRP7能够抑制RIG-I样受体介导的Ⅰ型干扰素通路的激活。7、NLRP7通过靶向效应器蛋白MAVS促进Ⅰ型干扰素。8、NLRP7通过抑制MAVS的自噬降解来稳定MAVS蛋白水平。结论本研究首次对DDXs家族成员在AIM2炎症小体激活通路上进行了系统的功能筛选,发现DDX10能够与AIM2相互作用,通过增强AIM2的蛋白稳定性而促进其介导的炎症小体激活和IL-1β的释放。本研究首次提出了NLRP7作为调控分子参与到RLRs介导的Ⅰ型干扰素通路中,发现了人类NLRs家族