桑树皱叶病毒变种П的致病性及其编码的V4和V5基因功能的研究

作     者：韩涛涛 

作者单位：江苏科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：卢全有

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：桑树皱叶病毒变种П 致病性 V4基因 V5基因 

摘      要：桑树具有重要的经济和生态效益,然而桑树在生长过程中受多种病害威胁,其中病毒病是影响桑树生长最为严重的病害之一。桑树皱叶病毒(Mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是双生病毒科(Geminiviridae)桑树皱叶病毒属(Mulcrilevirus)的成员,通过桑斑叶蝉及带毒的无性繁殖材料和苗木传播。MCLV遗传进化分析发现自然界中还存在一个变种(MCLV vП),然而MCLV vП的致病性以及MCLV编码的部分蛋白功能未知。为了更好地防治和应用MCLV,我们对MCLV vП致病性以及MCLV vП编码的V4和V5基因功能展开了研究。1.MCLV vП致病性利用PCR和同源重组的方法构建了农杆菌介导的含有2倍大的基因间隔区(Large intergenic region,LIR)的MCLV vП侵染性克隆(p CA-1.1MCLV),分别接种到其天然宿主桑树、实验植物番茄和本氏烟植株上,以明确MCLV vП对桑树的致病性及对实验植物的侵染性和致病性。结果显示,桑树、番茄和本氏烟分别在接种30 d、15 d和15d检测到侵染成功的植株,说明构建的p CA-1.1MCLV具有侵染性;p CA-1.1MCLVWT可以侵染番茄和本氏烟,且草本植物番茄和本氏烟接种成功率和接种响应速度都要高于和快于木本植物桑树,说明番茄和本氏烟可以作为MCLV研究的实验宿主;接种后检测为阳性的桑树在90 d的观察期内,其叶部没有表现出病毒感染样症状,接种后检测为阳性的番茄在45 d和本氏烟在25 d的观察期内均未表现出任何病毒感染样症状。2.V5基因在MCLV v II侵染本氏烟中起重要作用通过分析V5 m RNA的转录和V5 ORF上游序列的启动子活性,证实了V5基因在MCLV v II侵染的植株中是可以表达的。通过农杆菌介导的V5 ORF缺陷型MCLV v II突变病毒的侵染性克隆(MCLV,V5 ORF起始密码子突变)的侵染性实验和同源重组修复实验,研究V5基因在MCLV vП侵染本氏烟过程中的作用。含V5的MCLV vП可以系统侵染本氏烟植株,MCLV则不能;通过同源重组修复的MCLV可以系统侵染本氏烟植株。这些结果表明V5基因是MCLV vП侵染本氏烟植株所必需的,由此推测V5基因能帮助MCLV的系统运动或具有有扩展宿主范围的潜在功能。3.V4基因对MCLV改造成VIGS载体和MCLV复制的影响通过“做减法的方式删除了MCLV基因组中V4 ORF的部分序列,将MCLV改造成病毒诱导的基因沉默(virus-induced genesilencing,VIGS)载体,利用桑树、番茄和本氏烟的八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)作为沉默靶标基因验证VIGS载体的实用性。结果显示,MCLV改造的VIGS载体能够侵染桑树、番茄和本氏烟,侵染效率约70%;含PDS的VIGS载体也可以成功侵染桑树、番茄和本氏烟植株,但未诱发侵染植株产生相应的白化表型。V4基因的功能研究。通过分析V4基因的m RNA和V4 ORF上游序列的启动子活性,证实了V4基因在MCLV侵染过程中是可以表达的。通过构建农杆菌介导的V4ORF缺陷型(MCLV,V4 ORF起始密码子突变)和V4 ORF序列缺失型(MCLV)MCLV突变病毒的侵染性克隆,研究V4基因在MCLV侵染过程中的作用。尽管构建的MCLV和MCLV的侵染性克隆都能够系统侵染自然寄主桑树和实验植物番茄,但无论是在桑树还是番茄中,MCLV和MCLV基因组的复制量与野生型MCLV相比均显著降低,更有甚者,MCLV基因组的复制极显著地低于MCLV。这些结果显示,V4基因与MCLV基因组在寄主植物中的复制密切相关,V4 ORF序列的删除导致病毒基因组复制能力几乎丧失。本研究不仅明确了自然界存在的MCLV vП变种的致病性,也初步了解到V4和V5基因在MCLV侵染和复制中的作用,为MCLV的防控和后期研究提供了新的思路;同时为MCLV改造成VIGS载体应用于桑树功能基因的研究提供了理论意义。